Wasserstoffbeladene Augentropfen unterdrücken das Fortschreiten einer Keratokonus-ähnlichen Hornhautläsion der SKC-Maus

Abstrakt

Zweck : Keratokonus ist eine angeborene und idiopathische Hornhauterkrankung, die in der Pubertät auftritt und bis zum dritten oder vierten Lebensjahrzehnt fortschreitet. Die genaue Ätiologie des Keratokonus ist nicht geklärt; jedoch wurde kürzlich über eine Beteiligung von oxidativem Stress an der Pathogenese von Keratokonus berichtet. Die SKC-Maus ist eine Inzuchtlinie von spontan mutierten Mäusen mit Hornhäuten, die dem menschlichen Keratokonus ähneln. Mehr als 90 % der männlichen skc/stm-Mäuse entwickeln bis zum Alter von 3 Monaten eine Hornhautvorwölbung. Molekularer Wasserstoff ist ein neuartiges Antioxidans zur effizienten Reduzierung von oxidativem Stress. Es wird berichtet, dass das Einträufeln von wasserstoffbeladenen Augentropfen retinale Ischämie-Reperfusionsschäden oder Hornhautangiogenese nach Alkaliverbrennung abschwächt.

Methoden : Männliche SKC-Mäuse wurden in 2 Gruppen eingeteilt. Sieben Mäusen (Gruppe H) wurden wasserstoffbeladene Augentropfen mit physiologischer Kochsalzlösung in das rechte Auge eingeträufelt. Wasserstoffbeladene Augentropfen wurden durch Auflösen von H(2)-Gas in einer Kochsalzlösung bis zur Sättigung hergestellt und im Alter von 3 Wochen bis 12 Wochen fünfmal täglich auf die Augenoberfläche aufgetragen. Anderen 7 Mäusen (Gruppe P) wurden Augentropfen mit normaler physiologischer Kochsalzlösung eingeträufelt. Wir machten jede Woche Fotos von ihrer Hornhaut und verglichen die Häufigkeit des Auftretens von Keratokonus-ähnlichen Hornhautläsionen bis zum Alter von 24 Wochen.

Ergebnisse : Die Häufigkeit von Keratokonus-ähnlichen Läsionen betrug 28,6 % in der 6. Woche, 57,1 % in der 7. Woche, 71,4 % in der 9. Woche, 85,7 % in der 16. Woche und danach stabil in der Gruppe P und 14,3 % in der 6. Woche, 28,6 % in der 10. Woche, 42,9 % in der 12. Woche, 57,1 % in der 16. Woche und danach in der Gruppe H nicht erhöht. Die Häufigkeit keratokonusähnlicher Läsionen war in der Gruppe P von der 6. bis zur 9. Lebenswoche signifikant höher (p < 0,05 ).

Schlussfolgerungen : Mit Wasserstoff beladene Phosphat-Kochsalz-Augentropfen verhinderten und unterdrückten das Fortschreiten von Keratokonus-ähnlichen Hornhautläsionen bei SKC-Mäusen

  • Naoko Kato
    Augenheilkunde, National Defense Medical College, Saitama, Japan
    Augenheilkunde, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan
  • Yuichi Uchino
    Augenheilkunde, medizinische Fakultät der Keio-Universität, Tokio, Japan
  • Emi Inagaki
    Augenheilkunde, medizinische Fakultät der Keio-Universität, Tokio, Japan
  • Shigeo Ohta
    Biochemie und Zellbiologie, Institut für Entwicklungs- und Alterungswissenschaften, Graduate School of Medicine, Nippon Medical School, Kanagawa, Japan
  • Kazuo Tsubota
    Augenheilkunde, medizinische Fakultät der Keio-Universität, Tokio, Japan
  • Fußnoten
    Handelsbeziehungen Naoko Kato , keine; Yuichi Uchino , Santen Pharmaceutical (F); Emi Inagaki , keine; Shigeo Ohta , keiner; Kazuo Tsubota , AcuFocus, Inc (C), Allergan (F), Bausch Lomb Surgical (C), Funktionelles Sehschärfemessgerät (P), JiNS (P), Kissei (F), Kowa (F), Santen, Inc. ( F), Otsuka (F), Pfizer (C), Thea (C), Echo Denki (P), Nidek (F), Ophtecs (F), Wakasa Seikatsu (F), CEPT Company (P)
  • Unterstützung Keiner

Nächste Studie aus 2017:

 


Molekularer Wasserstoff heilt effektiv alkaligeschädigte Hornhaut durch Unterdrückung von oxidativem Stress

Cestmir Cejka , Jan Kossl , 1 , Barbora Hermankova , 1 , Vladimir Holan , 1 , und Jitka Cejkova 1 , *
1 Institut für Experimentelle Medizin, Tschechische Akademie der Wissenschaften, 14220 Prag 4, Tschechische Republik
2 Naturwissenschaftliche Fakultät, Karls-Universität, Vinicna 7, 12843 Prag 2, Tschechische Republik
*Jitka Cejkova: zc.sac.demoib@avokjec
Akademischer Herausgeber: Angel Catalá

Abstrakt

Das Ziel dieser Studie war es, die Wirkung von molekularem Wasserstoff (H 2 ) auf die Heilung von alkaligeschädigter Hornhaut zu untersuchen. Die Wirkungen der Lösung von H 2 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder PBS allein, topisch aufgetragen auf die alkaligeschädigte Kaninchenhornhaut mit 0,25 M NaOH, wurden unter Verwendung von immunhistochemischen und biochemischen Methoden untersucht. Die als Index der Hornhauthydratation genommene zentrale Hornhautdicke wurde mit einem Ultraschall-Pachymeter gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Spülung der geschädigten Augen mit H 2Lösung unmittelbar nach der Verletzung und dann innerhalb der nächsten fünf Tage erneute Hornhauttransparenz ging nach der Verletzung verloren und die verringerte Hornhauthydratation stieg nach der Verletzung auf physiologische Werte innerhalb von zehn Tagen nach der Verletzung an. Im Gegensatz dazu blieb bei verletzten Hornhäuten, die mit PBS behandelt wurden, die Transparenz der beschädigten Hornhäute verloren und die Hornhauthydratation war erhöht. Spätere Ergebnisse – am Tag 20 nach der Verletzung – zeigten, dass in alkaligeschädigten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden, die Expression von proinflammatorischen Zytokinen, Peroxynitrit, nachgewiesen durch Nitrotyrosinreste (NT), und Malondialdehyd (MDA) im Vergleich sehr gering oder nicht vorhanden waren zu mit PBS behandelten verletzten Hornhäuten, wo NT- und MDA-Expressionen vorhanden waren. Abschließend H2Lösung die Hornhautheilung nach Alkalischädigung durch Unterdrückung von oxidativem Stress günstig beeinflusst.

1. Einleitung

Eine Hornhaut-Alkali-Verletzung verursacht häufig eine ausgedehnte Schädigung der Augenoberfläche und des gesamten vorderen Augensegments, was zu einem teilweisen oder vollständigen Sehverlust führt. Unmittelbar nach Hornhautverletzungen, wie Alkaliverätzungen oder Bestrahlung der Hornhaut mit UVB-Strahlen, tritt oxidativer Stress in der Hornhaut auf [  –  ]. Die Aktivitäten sowie die Expression von antioxidativen Enzymen der Hornhaut nehmen erheblich ab, während die Aktivitäten von prooxidativen Enzymen (z. B. Oxidasen, die reaktive Sauerstoffspezies erzeugen, ROS) auf physiologischen Niveaus bleiben oder sogar zunehmen. Das antioxidative/prooxidative Ungleichgewicht scheint zu oxidativem Stress zu führen [ ]. ROS werden unzureichend gespalten. Mit dem Bestreben, die abgeschwächten Funktionen natürlich vorkommender Antioxidantien zu ersetzen, wurden mehrere synthetische Antioxidantien topisch auf die Augenoberfläche aufgetragen, mit dem Ziel, oxidativen Stress zu unterdrücken und die Hornhautheilung zu ermöglichen [  ,  ]. Ohta et al.  ] schlug vor, dass trotz der klinischen Bedeutung von oxidativen Schäden häufig verwendete Antioxidantien nur begrenzten therapeutischen Erfolg hatten. Ohsawaet al.  ] vorgeschlagen, dass H 2 ein Potenzial als neuartiges wirksames Antioxidans in präventiven und therapeutischen Anwendungen hat. Laut diesen Autoren hat H 2 als mildes, aber wirksames Antioxidans eine Reihe von Vorteilen: H 2diffundiert schnell in Gewebe und Zellen, und es ist nicht mild genug, um metabolische Redoxreaktionen zu stören oder ROS zu beeinflussen, die in der Zellsignalisierung funktionieren. 2 ist ein Inertgas und nur die starken Oxidationsmittel, beispielsweise Hydroxylradikale und Peroxynitrit, können es oxidieren. Mit anderen Worten reagiert H 2 mit starken Oxidationsmitteln wie Hydroxylradikalen und Peroxynitrit in Zellen und ist somit ein wirksames Mittel für präventive und therapeutische Anwendungen als Antioxidans. 2 kann im menschlichen Körper auf verschiedene Weise verbraucht werden, einschließlich Einatmen von H 2 , Trinken von Wasserstoffwasser (in H 2 gelöstes Wasser), Nehmen eines Wasserstoffbades, Injektion von in H 2 gelöster Kochsalzlösung, Tropfen von H 2auf das Auge und erhöht die Produktion von intestinalem H 2 durch Bakterien [  ].

Kubotaet al.  ] behandelte Hornhäute, die mit Alkali (0,15 M NaOH) mit verschiedenen Antioxidantien, einschließlich H 2 , verbrannt wurden . Die alkaligeschädigten Augen wurden 30 min lang mit H 2 -Lösung von 0,5–0,6 ppm gespült. Diese H 2 -Konzentration unterdrückte wirksam oxidativen Stress in der Hornhaut und reduzierte die Hornhautneovaskularisation. Das Ziel unserer Studie war zu untersuchen, ob eine H 2 -Lösung ähnlicher Konzentration (0,5–0,6 ppm) die Heilung von Hornhäuten beeinflussen kann, die mit konzentrierterem Alkali (0,25 M NaOH) verbrannt wurden. Die verletzten Augen wurden mit H 2 -Lösung (H 2 in PBS) oder H 2 -freiem PBS gespültunmittelbar nach der Verletzung und dann wiederholt für fünf Tage. Die Ergebnisse zeigen, dass nach der H 2 -Behandlung die nach der Verletzung verlorene Hornhauttransparenz schnell wiederhergestellt wurde und die zentrale Hornhautdicke, die nach der Verletzung zunahm, physiologische Werte erreichte. Am Tag 20 nach der Verletzung war bei mit H 2 behandelten Hornhäuten die intrakorneale Entzündung unterdrückt, die retrokorneale Membran war nicht entwickelt und die Hornhautneovaskularisation war reduziert. Dies stand im Gegensatz zu mit PBS behandelten alkaligeschädigten Hornhäuten, wo die intrakorneale Entzündung zusammen mit der retrokornealen Membran stark entwickelt war und die Hornhäute weitgehend vaskularisiert waren.

2. Materialien und Methoden

2.1. Herstellung einer H 2 -Lösung in PBS

Es wurden ein Original Dr. Hidemitsu Hayashi's Hydrogen Rich Water Stick und eine Original Dr. Hayashi Glasflasche (The Hydrogen Rich Water Group LLC Lawrence, KS, USA) verwendet. Die spezielle Glasflasche wurde mit dem PBS gefüllt und der Wasserstoffstab wurde in die Flasche eingetaucht. Die Flasche wurde ohne Totvolumen fest verschlossen. Die Flasche wurde 15 s geschüttelt und 45 min stehen gelassen. Danach wurde der Stick aus der Flasche gezogen. Die kleine Menge der fehlenden Lösung wurde mit PBS nachgefüllt und die Flasche fest verschlossen.

2.2. Messung der H 2 -Konzentration in PBS-Lösung

Für die Messung der Konzentration des gelösten molekularen Wasserstoffs in PBS (pH 7,2 kontinuierlich mit pH-Meter gemessen) wurde das Trustlex ENH-1000 (TRUSTLEX, Kyoto, Japan) als primäres Messgerät verwendet. Das Trustlex ENH-1000 ist ein original in Japan hergestelltes Gerät zur Messung von gelöstem Wasserstoff und zeigt den gelösten Wasserstoff mittels Wasserstoffreduktionsverfahren in ppm-Einheiten (Gew. H 2 /Vol. Lösung) an. Die Messmethode ähnelt der Messung des oxidativen Reduktionspotentials ORP, aber dieses Gerät verwendet eine ursprünglich entwickelte Elektrode zum Nachweis des gelösten Wasserstoffs. Das Gerät wird direkt in ppm kalibriert (die Messwerte sind in ppm).

Als Kontrollmethode für die Messung der Konzentration von molekularem Wasserstoff in PBS-Puffer wurde der Unisense H 2 -Mikrosensor verwendet. Dieser Mikrosensor ist der Sensor vom Clark-Typ, der den Wasserstoffpartialdruck misst. Das resultierende Sensorsignal liegt im pA-Strombereich. Dieses Signal wird vom Unisense Microsensor Multimeter gemessen. Die Messwerte des Multimeters können (gemäß Handbuch des Multimeters) auf die Konzentrationen des gelösten molekularen Wasserstoffs in PBS in mmol/L umgerechnet werden.

Die mit beiden Messmethoden erhaltenen Ergebnisse unterschieden sich maximal in 15% der absoluten Werte.

Für unsere Experimente (Augenspülung) wurde die Lösung in Glasspritzen aufbewahrt, die mit Stoppbechern ausgestattet waren. Es wurde darauf geachtet, dass in den Spritzen kein Totvolumen vorhanden war. Nach Ohta [  ] kann H 2 in Wasser bis zu 1,6 ppm, wt/vol (0,8 mM) unter atmosphärischem Druck gelöst werden. In unserer Studie betrug die unmittelbar nach Herstellung der Lösung gemessene 2 -Konzentration 0,6 ± 0,1 ppm wt/vol. Die H 2 -Konzentration nahm während der Augenspülung langsam auf die Konzentration von 0,5 ± 0,1 ppm wt/vol am Tag 5 ab. PBS-Lösung mit H 2 wurde am selben Tag hergestellt, an dem das Experiment begonnen wurde.

2.3. Alkalischädigung der Hornhaut bei Versuchstieren

Erwachsene weibliche weiße Neuseeland-Kaninchen (2,5–3,0 kg) wurden in unseren Experimenten verwendet. Die Untersuchung wurde gemäß dem ARVO Statement on the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research durchgeführt. Die Experimente wurden von der lokalen Ethikkommission des Instituts für Experimentelle Medizin unter der Nummer 11/2013 genehmigt. Kaninchen wurden durch eine intramuskuläre Injektion von Rometar (Xylazinum hydrochloricum, Spofa, Prag, CR, 2 %, 0,2 ml/kg Körpergewicht) und Narkamon (Ketaminum hydrochloricum, Spofa, 5 %, 1 ml/kg Körpergewicht) betäubt.

Natriumhydroxid (0,25 M NaOH) wurde durch Auftropfen auf die Hornhautoberfläche aufgebracht (20 Tropfen während 1 Minute). Anschließend wurden die Augen (bei der ersten Tiergruppe) sofort mit H 2 -Lösung gespült. Bei der zweiten Tiergruppe wurden die verletzten Augen mit PBS gespült. Diese Spülung der Augen in beiden Gruppen dauerte 10 Minuten, und dann wurden die Augen fünf Tage lang fünfmal täglich (immer für zwei Minuten) mit geeigneten Lösungen gespült. Einige verletzte Augen blieben ohne Behandlung.

Nach der Alkalischädigung und dem Erwachen aus der Narkose wurden die Kaninchen fünf Tage lang zweimal täglich mit Analgetika (Ketoprofen, 1,0 mg/kg im) behandelt. Die Tiere wurden nach einer iv-Injektion einer Thiopental-Anästhesie (Thiopental, Spofa, 30 mg/kg) nach Prämedikation mit einer intramuskulären Injektion von Rometar/Narkamon am Tag 20 nach der Verletzung getötet. Bei allen Experimenten mit Alkalischädigung diente die Hornhaut gesunder Kaninchenaugen als Kontrolle. Während des gesamten Experiments wurden Fotografien der Hornhäute gemacht.

2.4. Immunhistochemische Untersuchungen

Nach dem Töten der Tiere wurden die Augen enukleiert und die vorderen Augensegmente herauspräpariert und in mit einer Aceton-Trockeneis-Mischung gekühltem Petrolether abgeschreckt. Schnitte wurden auf einem Kryostaten geschnitten und auf Objektträger aus Glas übertragen. Anschließend wurden die Kryostatschnitte für 5 min bei 4°C in Aceton fixiert. Für den immunhistochemischen Nachweis von Cytokeratin K3/K12, induzierbarer Stickoxidsynthase (iNOS), Interleukin 1L - β (IL-1 β ), α -Glattmuskelaktin ( α-SMA), Nitrotyrosin (NT), Malondialdehyd (MDA) und vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) wurden die folgenden primären Antikörper verwendet: Anti-K3/12 (Abcam, Cambridge, UK), monoklonaler Maus-Anti-iNOS (Biosciences , San Jose, CA, USA), monoklonales Maus-Anti-NT (Abcam), polyklonales Ziege-Anti-MDA (US Biological, Swampscott, MA, USA), Maus-monoklonales Anti- α - SMA (Sigma, Saint Louis, MO, USA) , Anti-IL-1 β (Thermo Fisher Scientific, https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/antibodies.html) und monoklonalem Maus-Anti-VEGF (Abcam). Die Bindung der primären Antikörper wurde unter Verwendung des HRP/DAB Ultra Vision-Nachweissystems (Thermo Scientific, Fremont, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen: Wasserstoffperoxidblock (15 min), Ultra-V-Block (5 min), primärer Antikörper Inkubation (60 min), biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (Lab Vision, Fremont, CA) oder Esel-Anti-Ziege-IgG (Santa Cruz Biotechnology) Sekundärantikörper-Inkubation (10 Min) und Peroxidase-markiertes Streptavidin-Inkubation (10 Min). Die Visualisierung wurde unter Verwendung einer frisch zubereiteten DAB-Substrat-Chromogen-Lösung durchgeführt. Als negative Kontrollen dienten Kryostatschnitte, bei denen die primären Antikörper aus den Inkubationsmedien weggelassen wurden. Die Schnitte wurden mit Mayers Hämatoxylin gegengefärbt.

2.5. Bestimmung der Hornhautdicke

Änderungen der optischen Eigenschaften der Hornhaut nach der Verletzung und während der Heilung wurden durch Messung der zentralen Hornhautdicke (als Index der Hornhauthydratation genommen) bewertet (siehe [  ] im Detail). Kurz gesagt wurde die zentrale Hornhautdicke bei anästhesierten Tieren unter Verwendung eines Ultraschall-Pachymeters SP-100 (Tomey Corporation, Nagoya, Japan) in der Hornhautmitte gemessen. Die Hornhautdicke wurde an denselben Hornhäuten vor der Alkalischädigung (Hornhaut gesunder Augen) und zwei, fünf, zehn und zwanzig Tage nach der Verletzung (alle Versuchsgruppen) gemessen. Jede Hornhaut wurde viermal gemessen und der Mittelwert und die Standardabweichung der Dicke (in μm ) wurden berechnet.

2.6. Bewertung der Hornhautneovaskularisation und -transparenz

Zur Bewertung der Hornhautneovaskularisation wurde die Anzahl der Gefäße in jedem der 60°-Sektoren der Hornhautoberfläche gezählt. Aus fünf Messungen wurden der Mittelwert und die Standardabweichung gezählt. Dieses Verfahren wurde für jedes Auge aus einer passenden Augengruppe (Kontrolle, verletzt und mit H 2 -Lösung behandelt und verletzt und mit Puffer behandelt) angewendet.

2.7. Nachweis der Genexpression durch Real-Time PCR

Die Expression von Genen für K3, K12, IL-1 β und VEGF in Kontroll- und behandelten Hornhäuten wurde durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bestimmt. Hornhäute wurden unter Verwendung einer Vannas-Schere herausgeschnitten, in Eppendorf-Röhrchen überführt und sofort eingefroren. Das gefrorene Hornhautgewebe wurde dann homogenisiert und in 500 &  mgr ;l TRI-Reagenz (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) für die RNA-Isolierung gegeben. Die Details der RNA-Isolierung, Transkription und der PCR-Parameter wurden zuvor beschrieben [  ]. Kurz gesagt, Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von TRI-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Ein μg Gesamt-RNA wurde mit Desoxyribonuklease I (Promega) behandelt und anschließend zur reversen Transkription verwendet. Die Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung von Zufallsprimern (Promega, Madison, WI) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 25  &mgr ;m synthetisiertL, unter Verwendung von M-MLV-reverser Transkriptase (Promega). Die quantitative Echtzeit-PCR wurde in einem StepOnePlus-Echtzeit-PCR-System (Applied Biosystems) durchgeführt. Das relative Quantifizierungsmodell mit Effizienzkorrektur wurde angewendet, um die Expression des Zielgens im Vergleich zu GAPDH, das als Haushaltsgen verwendet wurde, zu berechnen. Zur Amplifikation wurden folgende Primer verwendet: GAPDH: 5'-CCCAACGTGTCTGTCGTG (Sense), 5'-CCGACCCAGACGTACAGC (Antisense), K3: 5''-GAACAAGGTCCTGGAGACCA (Sense), 5'-TTGAAGTCCTCCACCAGGTC (Antisense); K12: 5′′-AGGAGGTGGTGAATGGTGAG (Sinn), 5′-GTTGTTTCCCAGGAGCAAAA (Antisense). IL- 5'-CTGCGGCAGAAAGCAGTT (Sinn), 5'-GAAAGTTCTCAGGCCGTCAT (Antisense) und VEGF: 5'-CGAGACCTTGGTGGACATCT (Sinn), 5'-ATCTGCATGGTGACGTTGAA (Antisense). Die PCR-Parameter umfassten Denaturierung bei 95°C für 3 min, dann 40 Zyklen bei 95°C für 20 s, Annealing bei 60°C für 30 s und Elongation bei 72°C für 30 s. Fluoreszenzdaten wurden bei jedem Zyklus nach einem Elongationsschritt bei 80°C für 5 s gesammelt und mit der StepOne Software, Version 2.2.2 (Applied Biosystems) analysiert. Jedes einzelne Experiment wurde dreifach durchgeführt. In den Abbildungslegenden repräsentiert jeder Balken den Mittelwert ± Standardabweichung von 6 einzelnen Hornhäuten. InAbbildung 1der Wert der Kontrollhornhäute für K3 und K12 wird als 100 % angenommen, was den Werten der relativen Genexpression von 18800 für K3 und 1750 für K12 entspricht. InFigur 2der Wert von Kontrollhornhäuten für IL-1- β wird als 100 % angenommen, was dem Wert der relativen Genexpression 120 entsprichtAbbildung 5der Wert der Kontrollhornhäute für VEGF wird als 100 % angenommen, was dem Wert der relativen Genexpression 440 entspricht.

Der immunhistochemische Nachweis der Cytokeratine K3/K12 und die Expression von Genen für die Cytokeratine K3 (e) und K12 (f) bestimmt durch real-time PCR in verletzten Hornhäuten, die mit H 2 gelöst in PBS (H 2 ) oder mit PBS frei von H behandelt wurden 2 (Puffer) untersucht am Tag 20 nach der Verletzung. Die Expression von K3/K12 war in verletzten reepithelisierten Hornhäuten, die mit H 2 (c) behandelt wurden, hoch, Pfeil zeigt auf das Epithel, wohingegen in verletzten Hornhäuten, die mit Puffer behandelt wurden, wo Hornhäute schlecht reepithelisiert waren (Pfeile), die Expression von K3/K12 hoch war niedrig oder nicht vorhanden (a, b) im Vergleich zur Kontrollhornhaut (d). Maßstabsbalken: 50  μm . In Diagrammen stellen die Werte mit Sternchen statistisch signifikant dar ( ∗∗∗ P< 0,001) Unterschied zu verletzten, mit Puffer behandelten Hornhäuten.

Der immunhistochemische Nachweis von iNOS und IL-1 β und die Expression von Genen für IL-1 β (g) bestimmt durch real-time PCR in verletzten Hornhäuten, die mit H 2 gelöst in PBS (H 2 ) oder mit PBS frei von H 2 behandelt wurden (Puffer) am 20. Tag nach der Verletzung untersucht. Die Expression von iNOS (a) und IL-1 β (b) war in mit Puffer behandelten verletzten Hornhäuten hoch, Pfeile, wohingegen in H 2 -behandelten verletzten Hornhäuten die Expression von iNOS (c) und IL-1 β (d) niedrig war vollständig abwesend, ähnlich wie bei der Kontrollhornhaut für iNOS (e) oder IL-1 β (f). Maßstabsbalken: 50  μm. In der Grafik repräsentieren die Werte mit Sternchen einen statistisch signifikanten ( ∗∗∗ P < 0,001) Unterschied von verletzten, mit Puffer behandelten Hornhäuten.

Der immunhistochemische Nachweis des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) in verletzten Hornhäuten, die mit H 2 gelöst in PBS (H 2 ) oder mit PBS frei von H 2 (Puffer) behandelt wurden, wurde am Tag 20 nach der Verletzung untersucht. In mit Puffer behandelten Hornhäuten war die Expression von VEGF hoch (a), (Pfeile) und Hornhäute sind vaskularisiert, wohingegen die Expression von VEGF in geschädigten Hornhäuten nach H 2 -Behandlung im Vergleich zur Kontrollhornhaut (c) niedrig war (b). Maßstabsbalken: 50  μm . Die Expression von Genen für VEGF bestimmt durch real-time PCR (d). In den Diagrammen repräsentieren die Werte mit Sternchen einen statistisch signifikanten ( ∗∗ P < 0,01) Unterschied von verletzten, mit Puffer behandelten Hornhäuten.

2.8. Statistiken

Eine Analyse der Daten zeigte eine Normalverteilung und die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Vergleiche zwischen den zwei Gruppen wurden durch den Student's t - Test durchgeführt, und Mehrfachvergleiche wurden durch ANOVA analysiert. Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

3. Ergebnisse

In unserer Studie gab es neben zwei Gruppen von alkaligeschädigten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung oder mit PBS behandelt wurden, eine Gruppe von Tieren, die ohne Behandlung gelassen wurden, nachdem die Verletzung verwendet wurde. Darüber hinaus wurde die durch Alkali geschädigte Gruppe von Hornhäuten mit PBS behandelt, nachdem H 2 als Negativkontrolle verwendet wurde. Da sich die immunhistochemischen, biochemischen und makroskopischen Ergebnisse und Ergebnisse, die mit Ultraschall-Pachymeter von verletzten unbehandelten Hornhäuten und mit PBS behandelten Hornhäuten nach Spülung mit H 2 erhalten wurden, nicht signifikant von Ergebnissen unterschieden, die mit verletzten Hornhäuten erhalten wurden, die mit PBS behandelt wurden, haben wir die Ergebnisse mit verletzten nicht gezeigt unbehandelte Gruppe und mit PBS behandelte Gruppe nach Spülung mit H 2 .

3.1. Immunhistochemischer Nachweis von K3/K12, iNOS, IL-1 β , α - SMA, VEGF und Genexpression von K3, K12, IL-1 β und VEGF in gesunden Kontrollhornhäuten und in verletzten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung oder PBS behandelt wurden (Tag 20 nach der Verletzung)

Die Expression von K3/K12 war hoch bei verletzten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden (Abbildung 1(c)) (im Vergleich zur Kontrollhornhaut,Abbildung 1(d)), während die Expressionen in mit PBS behandelten Hornhäuten niedrig waren (Abbildung 1(b)), wo nur flaches Epithel vorhanden war (Abbildung 1(d)). Einige Hornhäute waren ohne Epithel (Abbildung 1(a)). Die Expression von Genen für K3 und K12 in Kontroll- (gesunden), verletzten, mit PBS behandelten und verletzten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden, wurde durch Echtzeit-PCR quantifiziert (Abbildungen1(e)und1(f)). Die Behandlung verletzter Hornhäute mit H 2 -Lösung erhöhte signifikant die Expression von K3 und K12. Die Expression von iNOS und IL-1 β war in verletzten Hornhäuten, die mit PBS behandelt wurden, hoch (Abbildungen2(a)und2(b)), während sie bei verletzten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden, gering oder nicht vorhanden waren (Abbildungen2(c)und2(d)), ähnlich wie bei Kontrollhornhäuten (Figuren2(e)und2(f)). Die Expression von Genen für IL-1 β (Abbildung 2(g)) in der Kontrolle (gesund), verletzten, mit PBS behandelten und verletzten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden, wurde durch Echtzeit-PCR quantifiziert. Die Expression von NT und MDA war in verletzten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden, nicht vorhanden (Abbildungen3(c)und3(d)), während die Expression von NT und MDA in verletzten, mit PBS behandelten Hornhäuten hoch war (Abbildungen3(a)und3(b)) im Vergleich zu Kontrollhornhäuten, bei denen die Expression von NT und MDA fehlte (Abbildungen3(e)und3(f)). Die Expression von α -SMA war im Hornhautstroma von verletzten PBS-behandelten Hornhäuten hoch (Abbildung 4(a)) und in der retrokornealen Membran (Abbildung 4(b)). Bei verletzten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden, war α -SMA im Hornhautstroma sehr niedrig (Abbildung 4(c)) und die retrokorneale Membran war nicht entwickelt (Abbildung 4(d)), ähnlich wie bei der Kontrollhornhaut (Figuren4(e)und4(f)). Die Expression des Gens für VEGF war in verletzten PBS-behandelten Hornhäuten hoch (Abbildung 5(a)) und fast nicht vorhanden bei verletzten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden (Abbildung 5(b)). Bei Kontrollhornhäuten (Abbildung 5(c)) VEGF-Expression fehlte. Die Expression des Gens für VEGF in Kontroll- (gesunden), verletzten, mit PBS behandelten und verletzten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden, wurde durch Echtzeit-PCR quantifiziert (Abbildung 5(d)).

Der immunhistochemische Nachweis von Nitrotyrosin (NT) und Malondialdehyd (MDA) in verletzten Hornhäuten, behandelt mit H 2 gelöst in PBS (H 2 ) oder mit PBS frei von H 2 (Puffer), untersucht am Tag 20 nach der Verletzung. In mit Puffer behandelten verletzten Hornhäuten waren die Expressionen von NT (a) und MDA (b) hoch (Pfeile). Dies stand im Gegensatz zu mit H 2 -Lösung behandelten verletzten Hornhäuten, wo die Expression von NT (c) und MDA (d) fehlte, ähnlich wie bei Kontrollhornhäuten (e, f). Maßstabsbalken: 50  μm .

Der immunhistochemische Nachweis von &agr; -SMA in verletzten Hornhäuten, die mit H 2 gelöst in PBS (H 2 ) oder mit PBS frei von H 2 (Puffer) behandelt wurden, wurde am Tag 20 nach der Verletzung untersucht. Die Expression von α -SMA war im Hornhautstroma verletzter Hornhäute, die mit Puffer (a) (Pfeil) behandelt wurden, und in der retrokornealen Membran (Pfeil) (b) hoch, wohingegen die Expression von α -SMA in verletzten Hornhäuten, die mit H 2 behandelt wurden, hoch war niedrig im Hornhautstroma (c) und die retrokorneale Membran war nicht entwickelt (d) im Vergleich zur Kontrollhornhaut (e, f). Maßstabsbalken: 50  μm .

3.2. Hornhauttrübung und Neovaskularisation von alkaligeschädigten Augen, behandelt mit H 2 -Lösung oder PBS

Repräsentative Fotografien von gesunden und verletzten Augen, die mit H 2 -Lösung oder PBS behandelt wurden, sind in gezeigtAbbildung 6. Im Vergleich zu den gesunden Kontrollaugen (Abbildung 6(a)), Hornhäute verletzter Augen wurden unmittelbar nach der Verletzung opaleszierend (Abbildung 6(b)). Nach der PBS-Behandlung blieben die verletzten Hornhäute bis zum 20. Tag opaleszent, und in den letzten Tagen waren die Hornhäute vaskularisiert. Dies stand im Gegensatz zu mit H 2 -Lösung behandelten Hornhäuten, bei denen die Hornhauttransparenz während fünf Tagen nach der Verletzung erneuert wurde und die Hornhautneovaskularisation bis zum 20. Tag stark unterdrückt war.

Hornhauttrübung von alkaligeschädigtem Auge und verletzten Augen, die mit in PBS (H 2 ) gelöstem H 2 oder mit H 2 -freiem PBS ( Puffer) behandelt wurden. Repräsentative Fotografien zeigen ein gesundes Kontrollauge (a), ein alkaligeschädigtes Auge (unmittelbar nach der Verletzung) (b), das verletzte Auge, das von Tag 2 bis Tag 20 mit H 2 -Lösung behandelt wurde (c, d, e, f), und verletzt Auge behandelt mit Puffer von Tag 2 bis Tag 20 (g, h, i, j). Die Hornhauttransparenz wurde nur bei mit H 2 -Lösung behandelten Hornhäuten erneuert . Mit Puffer behandelte Hornhäute blieben opaleszierend und Hornhäute waren vaskularisiert. Pfeile zeigen auf Schiffe.

3.3. Zentrale Hornhautdicke nach Alkalischädigung und Behandlung mit H 2 -Lösung oder PBS

Kurz nach der Alkaliverletzung stieg die Dicke der zentralen Hornhaut um mehr als das Doppelte an (im Vergleich zu den Werten vor der Verletzung, Tag 0), und bei PBS-behandelten verletzten Hornhäuten blieb sie bis zum 20. Tag nach der Verletzung erhöht. Bei mit H 2 -Lösung behandelten Hornhäuten war die Dicke der zentralen Hornhaut von Tag zwei bis Tag fünf verringert, und am Tag 10 kehrte die Hornhautdicke zu den Werten vor der Verletzung (Tag 0) zurück (Abbildung 7(a)). Die Quantifizierung der Hornhautneovaskularisation ist in zusammengefasstAbbildung 7(b).

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Dicke der zentralen Hornhaut der (gesunden) Kontrollhornhaut und der durch Alkali geschädigten Hornhäute, die mit in PBS (H 2 ) gelöstem H 2 oder mit H 2 -freiem PBS ( Puffer) (a) behandelt wurden. Die zentrale Hornhautdicke wurde bei demselben Kaninchen vor der Verletzung (Tag 0) und an den Tagen 2, 5, 10 und 20 nach der Verletzung gemessen. Bei mit Puffer behandelten verletzten Hornhäuten und bei mit H 2 -Lösung behandelten verletzten Hornhäuten sind die Werte für die Tage 2 und 5 statistisch unterschiedlich ( ∗∗ P < 0,01, ∗∗∗ P < 0,001) von den Werten vor der Verletzung. In H2Bei behandelten verletzten Hornhäuten unterscheiden sich die Werte für die Tage 10 und 20 nicht signifikant (ns) von den Werten vor der Verletzung. Dies steht im Gegensatz zu mit Puffer behandelten verletzten Hornhäuten, wo die Werte für die Tage 10 und 20 statistisch unterschiedlich bleiben (  P < 0,05, ∗∗∗ P < 0,001) von den Werten vor der Verletzung. Die Quantifizierung der Hornhautneovaskularisation ist in (b) gezeigt. Die Anzahl der Gefäße war bei mit Puffer behandelten verletzten Hornhäuten hoch und war bei mit H 2 behandelten verletzten Hornhäuten signifikant reduziert . Die Werte mit Sternchen unterscheiden sich signifikant ( ∗∗∗ P < 0,001) von Werten mit Puffer-behandelten verletzten Hornhäuten.

4. Diskussion

Bei chemischen Hornhautverbrennungen, wie dem Verbrennen der Hornhaut mit Natronlauge, dringt Alkali schnell durch die Hornhaut in das innere Auge ein und schädigt das Gewebe, und daher sind ein Notfalleingriff und eine frühzeitige wirksame Therapie zur Wiederherstellung des Sehvermögens erforderlich. 2 hat sich für diese Zwecke als geeignet erwiesen. 2 hat auch in hoher Konzentration keine Zytotoxizität [  ]. Es dringt schnell in Gewebe und Zellen ein und unterdrückt oxidativen Stress, der unmittelbar nach der Verletzung im vorderen Augenabschnitt auftritt, wie z. B. Alkaliverbrennungen oder UVB-Bestrahlung [  –  ]. Nach Hornhautverletzungen trat ein Ungleichgewicht zwischen Antioxidantien und Prooxidantien in der Hornhaut auf, was zu oxidativem Stress führte. Wakamatsuet al. [ ] beschrieben, dass ein Ungleichgewicht zwischen freien Radikalen erzeugenden und Radikalfängersystemen, das zu oxidativem Stress führt, einen Zustand darstellt, der mit der Zellschädigung in Verbindung gebracht wurde, die bei vielen pathologischen Zuständen beobachtet wird. Laut diesen Autoren sind die Wirkungen von ROS weitreichend, aber drei Reaktionen sind besonders relevant für Zellverletzungen: Lipidperoxidation von Membranen, oxidative Modifikation von Proteinen und oxidative Schädigung von DNA. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung von alkaligeschädigter Hornhaut mit H 2 -Lösung den oxidativen Stress in der Hornhaut stark unterdrückte, was zu einer günstigen Hornhautheilung führte. Während 10 Tagen nach der Verletzung mit Alkali und wiederholter Spülung der verletzten Augen mit H 2Lösung, Hornhauttransparenz – verloren nach der Verletzung – stark wiederhergestellt (Abbildung 6) und zentrale Hornhautdicke (Hornhauthydratation) – erhöht nach der Verletzung – erreichte Werte vor der Verletzung (Abbildung 7). Später (am Tag 20 nach der Verletzung) waren bei alkaligeschädigten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden, die Expressionen von NT und MDA niedrig oder fehlten, während bei PBS-behandelten verletzten Hornhäuten NT- und MDA-Expressionen vorhanden waren (Figur 3). Es wird vermutet, dass H 2 schnell in die Hornhaut eindringt, nachdem es auf die geschädigte Augenoberfläche getropft wurde, die Bildung von Peroxynitrit und die Lipidperoxidation in der Hornhaut wirksam verhindert oder stark unterdrückt. Laut Ohsawa et al.  ] H 2 spaltet die Hydroxylradikale und verhindert so die anschließende Lipidperoxidation, DNA-Oxidation und mitochondriale Dysfunktion. Gemäß diesen Autoren verringerte die Inhalation von H 2 in einem Rattenmodell einer zerebralen Ischämie-Reperfusionsschädigung wirksam die ROS-induzierte Hirnschädigung. Ohta [  ] beschrieb, dass H 2 nicht nur Wirkungen gegen oxidativen Stress, sondern auch verschiedene entzündungshemmende und antiallergische Wirkungen zeigt. In unserer Studie H 2Lösung signifikant intrakorneale Entzündung unterdrückt (Figur 2).

Die mit PBS behandelten alkaligeschädigten Hornhäute heilten mit Fibrose und Narbenbildung. In diesen Hornhäuten waren hohe Expressionen von α -SMA (ein Marker für Myofibroblasten) vorhanden (Figur 4). Myofibroblasten differenzieren sich von stromalen Keratozyten in der Nähe der Wunde [  ]. Myofibroblasten sind für die Hornhautheilung notwendig; ihre Akkumulation und Persistenz in verletzten Bereichen ist jedoch mit Hornhautnarben verbunden [  ]. Myofibroblasten produzieren die anomale extrazelluläre Matrix, die zur Hornhauttrübung beiträgt [  ]. In unserer Studie heilten bei alkaligeschädigter Hornhaut, die mit H 2 -Lösung behandelt wurde, beschädigte Hornhäute mit der wiederhergestellten Hornhauttransparenz (Abbildung 6). Im verletzten Teil des Hornhautstromas war die Expression von α -SMA reduziert (Figur 4). Myofibroblasten, die hohe Spiegel von α -SMA exprimieren [  –  ], werden durch proinflammatorische Zytokine wie IL-6 und IL-1 β [  ,  ] moduliert. In unserer Studie waren bei verletzten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden, die Spiegel von IL-1 β reduziert (Figur 2). Dies steht im Einklang mit früheren Arbeiten, in denen eine signifikante Unterdrückung von proinflammatorischen Zytokinen und Schäden durch oxidativen Stress nach einer H 2 -Therapie in verschiedenen erkrankten Geweben und Organen beschrieben wurde (z. B. [  ]).

Myofibroblasten produzieren Stickoxid durch iNOS als Reaktion auf eine Zytokinstimulation [  ]. Neben Myofibroblasten exprimieren auch Hornhautzellen und Entzündungszellen iNOS in erkrankten Hornhäuten [  ]. Dies entspricht unseren Erkenntnissen. Hohe iNOS-Expressionen waren in mit PBS behandelten alkaligeschädigten Hornhäuten vorhanden, während in verletzten Hornhäuten, die mit H 2 behandelt wurden, die iNOS-Expression signifikant reduziert war oder vollständig fehlte (Figur 2).

Die Entwicklung der retrokornealen Membran nach der Verletzung mit konzentrierterem Alkali bedroht ernsthaft das Sehvermögen [  ]. Während der Heilung geschädigter alkaligeschädigter Hornhäute wird die Faserstruktur in der Endothelschicht unter der Descemet-Membran gebildet [  ]. Gemäß diesen Autoren durchlaufen Hornhautendothelzellen während der fibrogenen Reaktion einen mesenchymalen Übergang und wandeln sich in Myofibroblasten um. In dieser Studie wurde die retrokorneale Membran in PBS-behandelten alkaligeschädigten Hornhäuten gebildet und fehlte in verletzten Hornhäuten, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden (Figur 4).

5. Schlussfolgerungen

Die Behandlung alkaligeschädigter Hornhäute mit H 2 -Lösung beeinflusste die Hornhautheilung günstig durch antioxidative und entzündungshemmende Wirkungen. Wie bereits früher festgestellt wurde [  ,  ] , reduziert H 2 selektiv starke Oxidationsmittel wie Hydroxylradikale und Peroxynitrit und zeigt zytoprotektive Wirkungen gegen oxidativen Stress [  ]. Kubotaet al.  ] fanden heraus, dass die H 2 -Therapie der Hornhaut, die mit einer niedrigeren Alkalikonzentration (0,15 M NaOH) verbrannt war, die ROS-Produktion in der Hornhaut und die Hornhautneovaskularisation reduzierte. Wir haben in dieser Studie untersucht, dass H 2Lösung unterdrückte wirksam oxidativen Stress in der Hornhaut und verringerte die Hornhautneovaskularisation, selbst wenn die Hornhaut mit höher konzentriertem Alkali (0,25 M NaOH) verbrannt wurde. Nach der H 2 -Behandlung wurde Peroxynitrit, ein Produkt aus der Reaktion von Superoxid mit Stickoxid, reduziert und die Bildung von MDA wurde verhindert oder verringert. MDA dient als Marker für oxidativen Stress [  ]. Darüber hinaus verhinderte H 2 die Bildung einer retrokornealen Membran, einer gefürchteten Komplikation von Hornhaut-Alkali-Verbrennungen, wodurch ein Restsehvermögen unmöglich gemacht wurde. Verletzte Hornhäute, die mit H 2 -Lösung behandelt wurden, heilten unter Erneuerung der Hornhauttransparenz ohne Narbenbildung und Neovaskularisation. 2 hat eine starke Antinarbenwirkung. Denn h2 in menschlichen Zellen therapeutisch sehr wirksam und gleichzeitig nicht toxisch und nicht funktionell ist [  ], kann es separat zur Behandlung verschiedener Augenerkrankungen oder in Kombination mit anderen erforderlichen Therapien eingesetzt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die H2-Therapie des vorderen Augenabschnitts nach Alkaliverbrennungen der Hornhaut für die Wiederherstellung des Sehvermögens ähnlich wirksam war wie die H2-Therapie der zuvor beschriebenen Erkrankungen des hinteren Augenabschnitts [  –  ].

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grant 14-12580S von der Grant Agency of the Czech Republic, Project 80815 von der Grant Agency of Charles University und den Projekten SVV 260206, CZ.1.05/1.1.00/02.0109, CZ.2.16/3.1. 00/21528, UNCE 204013, NPU-I: LO1508 und NPUI: LO1309. Die Autoren danken Professor Pavel Matejka, Universität für Chemie und Technologie, Prag, und Dr. Stanislava Matejkova, IOCB AS CR, Prag, für ihre fachkundige Beratung auf dem Gebiet der analytischen Chemie.

Abkürzungen

ROS: Reaktive Sauerstoffspezies
NT: Nitrotyrosin
MDA: Malondialdehyd
K3, K12: Zytokeratine K3, K12
IL-  : Interleukin-1 β
IL-6: Interleukin-6
iNOS: Induzierbare Stickoxid-Synthase
α -SMA: α Aktin der glatten Muskulatur
TGF- β1 : Transformierender Wachstumsfaktor Beta 1
VEGF: Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor.

Zusätzliche Punkte

Höhepunkte . Alkali verursacht Hornhautschäden, die zu Sehstörungen führen. Bei alkaligeschädigter Hornhaut tritt oxidativer Stress auf. Das Ungleichgewicht zwischen Antioxidantien und Prooxidantien führt zu oxidativem Stress. Die Unterdrückung von oxidativem Stress durch H 2 -Behandlung führt zu einer günstigen Hornhautheilung.

Interessenskonflikte

Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

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                                                Anzeigen:

Die Studien sind u.a. entnommen  aus :

www.molecularhydrogenfoundation.org, Molecular Hydrogen Foundation, USA, Tyler Le Baron

 

http://www.eimht.eu/ European Institut for Molecular Hydrogen Therapy

  

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ US National Library of MedicineNational Institutes of Health

 

http://www.molecularhydrogenstudies.com und öffentlichen wissenschaftlichen Medien, medical gas Research,Plus.org, science direkt u.a.  Wir danken der molecular Hydrogen foundation für die freundliche Genehmigung, Artikel und wissenschaftliche Grundlagen veröffentlichen zu dürfen, als auch anderen Instituten .