Bei der Phakoemulsifikation induziert Ultraschall die Bildung von Hydroxylradikalen (·OH), wodurch das Endothel der Hornhaut geschädigt wird. Ob H 2 solche oxidativen Schäden bei der Phakoemulsifikation verhindern kann, wurde durch In-vitro- und In-vivo- Studien untersucht. H 2 wurde in einer handelsüblichen Spüllösung gelöst. Die Wirkungen von H 2 gegen die ·OH-Erzeugung wurden zuerst in vitro durch Elektronenspinresonanz (ESR) und Hydroxyphenylfluorescein (HPF) bestätigt. Die ESR zeigte eine signifikant verringerte Signalgröße und die Fluoreszenzintensität durch oxidiertes HPF war signifikant geringer in der H 2 -gelösten Lösung. Die Wirkung von H2in der Phakoemulsifikation wurden bei Kaninchen bewertet, wobei H 2 -gelöste und Kontrolllösungen verglichen wurden. Fünf Stunden nach dem Eingriff wurde die gesamte Hornhaut entfernt und einer Bildanalyse auf Hornhautödem, semiquantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) für Hämoxygenase (HO)-1, Katalase (CAT), Superoxiddismutase 1 (SOD1) und SOD2 unterzogen mRNA und Immunhistochemie. Das Hornhautödem war signifikant geringer und die Erhöhungen der antioxidativen HO-1-, CAT- und SOD2-mRNA-Expression waren in der H 2 -Gruppe signifikant unterdrückt. Darüber hinaus waren die Hornhaut-Endothelzellenexpressionen von zwei oxidativen Stressmarkern, 4-HNE und 8-OHdG, in der H 2 -Gruppe signifikant niedriger. Abschließend H2gelöst in der Augenspüllösung schützten die Endothelzellen der Hornhaut vor Phakoemulsifikations-induziertem oxidativem Stress und Schaden.

Die meisten Kataraktoperationen werden heute durch Phakoemulsifikation durchgeführt, bei der hochintensive Ultraschallenergie (US) zur Fragmentierung und Emulgierung der Linse verwendet wird. Mit dem Fortschritt bei chirurgischen Geräten und der Entwicklung von Techniken haben sich die Indikationen für die Phakoemulsifikation nun erweitert, um den reifen Katarakt einzuschließen, bei dem der Linsenkern hart ist, so dass eine größere US-Energie für die Emulgierung benötigt wird. Da menschlichen Hornhautendothelzellen in vivo keine mitotische Aktivität fehlt, kann eine übermäßige Schädigung des Gewebes zu einer signifikanten Abnahme der Endothelzelldichte führen. Hornhautendothel hält die Hydratation des Hornhautgewebes aufrecht, indem es als Barriere und Drainagepumpe gegen das Kammerwasser wirkt; Daher kann eine Abnahme der Endothelzelldichte ein irreversibles Hornhautödem (bullöse Keratopathie; BK) hervorrufen, was wiederum dauerhaft verschwommenes Sehen und Schmerzen verursacht. Bei zu hoher US-Energie 1 , 2 Kollision von Linsenkernfragmenten mit dem Hornhautendothel 3 , Luftblasen 4 , 5 oder lokaler Temperaturanstieg 6 , 7 , 8wurden berichtet und sind als Faktoren bekannt, die das Hornhautendothel schädigen. Die Entstehung freier Radikale wurde auch als schädlicher Faktor im Zusammenhang mit der Verwendung von US identifiziert. In Anbetracht der oxidativen Schädigung von Endothelzellen durch freie Radikale kann ihre Anwesenheit in der Vorderkammer einer der schädlichsten Faktoren während dieser Verfahren darstellen.

In den Bereichen Physik und Technik ist bekannt, dass hochintensive US-Oszillationen in einer wässrigen Lösung freie Radikale induzieren 9 . Ursache ist die akustische Kavitation, ein Phänomen, bei dem Gasblasen durch Ebullismus oder Verdunstung entstehen und unter Unterdruck wachsen und dann unter Überdruck infolge von US-Druckschwankungen kollabieren. Wenn Blasen kollabieren, erzeugen sie Stoßwellen, die lokalisierte hohe Drücke von >600 Atmosphären und Temperaturerhöhungen von >5000 K induzieren. Die erzeugte Energie breitet sich auf benachbarte Wassermoleküle aus und verursacht einen direkten Zerfall. Dieses Phänomen (H 2O→·OH +·H) wird Sonolyse genannt, und das ·OH, dh das Hydroxylradikal, ist die reaktivste der verschiedenen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), einschließlich Superoxidanion, Singulett-Disauerstoff und Wasserstoffperoxid. Die Produktion von ·OH durch einen ophthalmischen Phakoemulgator wurde zuerst von Cameron et al . 10 . Sie detektierten ·OH mittels Elektronenspinresonanz (ESR) in einem geschlossenen Kreislauf und zeigten, dass die ·OH-Produktion proportional zur US-Oszillationszeit war. Wir demonstrierten dann auch die ·OH-Produktion durch ESR in der Vorderkammer eines Modellauges unter klinischen Bedingungen der Phakoemulsifikation 11. Darüber hinaus haben wir anhand von 8-Hydroxy-2-desoxyguanosin (8-OHdG) als Marker für oxidativen Stress in Tieraugen bewiesen, dass durch Phakoemulsifikation produzierte freie Radikale die Ursache für Endothelschäden der Hornhaut waren 12 .

Um die Vorderkammer des Auges zu erhalten und das Hornhautendothel vor verschiedenen Formen von chirurgischen Schäden während der Phakoemulsifikation zu schützen, wird als Standardverfahren vor der Phakoemulsifikation ein ophthalmologisches viskosurgisches Gerät (OVD) in die Vorderkammer injiziert. Der Hauptbestandteil eines OVD ist Natriumhyaluronat (HA), das ein bekannter Fänger freier Radikale ist. Die schützenden Eigenschaften von HA gegen oxidativen Stress im Hornhautendothel wurden beschrieben 13 und wir haben auch die abfangende Wirkung von OVD gegenüber ·OH in einer Augenmodellstudie gezeigt 11 , 14 . Die Wirkung des Materials hängt jedoch von seiner Retention in der Vorderkammer während der Phakoemulsifikation ab 11 , 14, weil das Material abgesaugt werden kann und im Verlauf der Operation verschwindet. Es wurde auf ein neues Verfahren zum konstanten Schutz vor oxidativen Angriffen während einer Operation gewartet.

Ein vielversprechender Kandidat für diesen Zweck ist das Wasserstoffmolekül H 2 . 2007 berichteten wir, dass H 2 selektiv zytotoxische ROS, insbesondere ·OH, in vitro reduzierte und eine therapeutische antioxidative Aktivität in einem Ischämie-Reperfusions-Verletzungsmodell ausübte 15 . Seitdem wurde über die Wirkung von H 2 gegen durch oxidativen Stress verursachte Verletzungen in mehreren Organen, einschließlich Gehirn, Herz, Lunge, Darm oder Knochenmark, berichtet 16 , 17 , 18 , 19 . Auf dem Gebiet der Ophthalmologie berichteten wir, dass H 2 wirksam war, um eine Ischämie-Reperfusionsschädigung in der Netzhaut in einem Netzhautarterien-Okklusionsmodell zu verhindern20 . In Anbetracht der Wirkung von H 2 gegen ·OH solltein Augenspüllösungen gelöstes H 2 als Fänger freier Radikale in der Vorderkammer wirken. In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung von H 2 bei der Phakoemulsifikation. Wir haben gezeigt, dass US bei der Phakoemulsifikation ·OH induziert, das das Endothel der Hornhaut schädigt 11 , 12 . Wenn in Augenspüllösungen gelöstesH 2 eine oxidative Schädigung des Hornhautendothels verhindern könnte, hätte es einen großen klinischen Nutzen.

H 2 -Konzentration in der Lösung

Um die in H 2 gelöste Augenspüllösung herzustellen, wurden Beutel, die die Lösung enthielten, in H 2 -Gas gegeben . Nachdem die Lösung 24 Stunden und 1 Woche lang 100 % H 2 -Gas in einer Acrylkammer ( Fig. 1a ) ausgesetzt war, betrug die gelöste Konzentration von H 2 in der Lösung 61,9 % bzw. 61,8 %, was darauf hinweist, dass H 2 Gas leicht durch einen Plastikbeutel drang und dass die Lösung mit H 2 -Gas in der Kammer innerhalb von 24 Stunden nahezu äquilibriert wurde. Somit wurde die in H 2 gelöste Spüllösung nach 24-stündiger Einwirkung für die folgenden Experimente verwendet. Die H2Die Konzentration in der vorderen Augenkammer des Schweineauges ( 1b ) unter kontinuierlicher Spülung (10 ml/min) mit der H 2 -gelösten Lösung für 30 Minuten zeigte wenig Veränderung, von 56,5 % auf 53,7 % ( 1c ). Um die O 2 -Versorgung des Gewebes zu bestätigen, wurde auch die O 2 -Konzentration gemessen. Nach 2-minütiger Spülung mit der in H 2 gelösten Lösung betrug die O 2 -Konzentration in der Vorderkammer 5,4 % ± 0,6 %.

Eine Schädigung des Hornhautendothels führt zu einem Hornhautödem, und wenn die Schädigung übermäßig ist, führt dies zu einer irreversiblen bullösen Keratopathie (BK). Da die Endothelzellen der Hornhaut nicht in der Lage sind, sich zu regenerieren, ist die Transplantation von Hornhautgewebe derzeit die einzige verfügbare Heilung. Eine kürzlich durchgeführte nationale Umfrage zu BK in Japan zeigte, dass die Kataraktoperation die häufigste Ursache für eine perforierende Keratoplastik war (24,2 %) 21 und eine neuere Studie in Großbritannien zeigte, dass die Kataraktoperation unter den Indikationen für die endotheliale Keratoplastik an zweiter Stelle nach Fuchs' Endotheldystrophie 22. Darüber hinaus ist eine korneale Endothelschädigung in einem begrenzten Bereich eine der häufigsten Komplikationen nach einer Phakoemulsifikation, wenn sie nicht zu einer irreversiblen BK führt, und kann bei vielen Post-Phakoemulsifikationspatienten eine vorübergehende Sehstörung verursachen. Auch wenn die Sicherheit der Phakoemulsifikation aufgrund der Fortschritte bei der Apparatur und der Entwicklung von chirurgischen Geräten, einschließlich OVDs, dramatisch verbessert wurde, ist die Verhinderung einer Schädigung des Hornhautendothels bei der Phakoemulsifikation immer noch ein wichtiges Thema für Kataraktchirurgen.

Die Wirkung von H 2 als Radikalfänger wurde intensiv unter verschiedenen Bedingungen in vitro oder in vivo untersucht 23 , seit unser Bericht erstmals seine Wirkung beschrieben hat 15 . Wir haben zuerst gezeigt, dass H 2 dosisabhängig ·OH in vitro reduziert , wohingegen H 2 zu schwach ist, um physiologisch wichtige ROS wie NO· und Superoxid zu reduzieren. H 2 , das kleinste Molekül im Universum, hat die einzigartige Fähigkeit, schnell durch Membranen zu diffundieren; es kann in allen Organellen, einschließlich der Mitochondrien und des Zellkerns, mit zytotoxischem ·OH reagieren und schützt so die Zellen wirksam vor oxidativen Schäden. Tatsächlich H2verhinderten eine Abnahme der zellulären ATP-Spiegel, die in Mitochondrien 15 synthetisiert wurden .

Bei der Phakoemulsifikation wurde eine ·OH-Produktion durch US nachgewiesen 10 , 11 und eine Hornhautendothelschädigung durch oxidative Angriffe wurde ebenfalls nachgewiesen 12 . In Anbetracht der Wirkung von H 2 und der Folgen der Sonolyse bei der Phakoemulsifikation erschien es sinnvoll und lohnenswert, die Nützlichkeit von in der Spüllösung gelöstem H 2 zu untersuchen , da mit dieser Methode während der Operation kontinuierlich ein potenter Radikalfänger bereitgestellt werden kann .

In der aktuellen Studie wurde zunächst die H 2 -Konzentration in der Spüllösung untersucht. H 2 wurde in Lösung gelöst, indem der Beutel in eine Kammer mit 100 % H 2 gegeben wurde . H 2 dringt auch ohne Überdruck in der Kammer spontan durch die Plastikfolie des Beutels. Dies war möglich, da es sich bei der Lösung Ope Guard ® neo kit um ein weiches Kunststoffprodukt handelt, weshalb diese Lösung verwendet wurde. Die H 2 -Konzentrationen in den 24-Stunden- und 1-Wochen-Expositionslösungen waren fast gleich, was auf H 2 hinweistwurde bei dieser Methode durch 24-stündige Einwirkung in der Lösung fast gesättigt. Obwohl dieses Verfahren den Vorteil hat, Bedenken hinsichtlich einer Kontamination zu beseitigen, nahm die H 2 -Konzentration in dem Beutel allmählich ab, nachdem er aus der Kammer entnommen wurde, da H 2 aus dem Beutel entweichen kann. Um seine Gültigkeit im klinischen Einsatz zu bestätigen, wurde die H 2 -Konzentration unter klinischen Bedingungen gemessen. Nach 30 Minuten kontinuierlicher Spülung betrug die H 2 -Konzentration in der Vorderkammer immer noch 53,7 %, was darauf hindeutet, dass eine ausreichende H 2 -Konzentration während einer Standard-Phakoemulsifikationszeit aufrechterhalten werden kann ( 1 ). Darüber hinaus ist die O 2-Konzentration in der Vorderkammer (5,4 %) wurde in Anbetracht der kurzen Operationszeit und der berichteten O 2 -Konzentration im Kammerwasser des menschlichen Auges als innerhalb eines sicheren Bereichs bestätigt 24 .

Die Auswirkungen von H 2 auf die durch US verursachte ·OH-Produktion wurden dann in In- vitro -Experimenten unter Verwendung von ESR- und HPF-Analyse untersucht. Die US-Oszillation in der Röhre wurde wie in unserem vorherigen Bericht 11 durchgeführt . Die Ergebnisse beider Analysen zeigten klar, dass H 2 die ·OH-Produktion unterdrückte ( 2 ). Als nächstes wurde eine Phakoemulsifikationssimulation in Tieraugen durchgeführt, um die Wirkung von H 2 in einem In-vivo - Modell zu beobachten. Bei dem Verfahren wurde die Linse nicht berührt, um die Wirkung von Linsenfragmenten auf eine Schädigung des Hornhautendothels zu vermeiden. Der Unterschied zwischen H2Gruppe und der Kontrollgruppe war offensichtlich. Die durch Bildanalyse bewertete Fläche der ödematösen Hornhautläsion war in der H 2 -Gruppe signifikant kleiner ( 3 ), was darauf hindeutet, dass H 2 das Hornhautendothel vor oxidativen Angriffen schützte. Um die physiologische Reaktion auf freie Radikale in den Hornhaut-Endothelzellen zu beobachten, wurde anschließend die Expression von HO-1 mRNA in den Zellen nach US-Exposition untersucht. HO-1 entfernt das prooxidative Molekül Häm und erzeugt Radikalfänger, Biliverdin und Bilirubin; Daher wird HO-1 normalerweise als ein Antioxidans-induzierbares zelluläres Abwehrprotein angesehen, und ein Anstieg der HO-1-mRNA zeigt an, dass oxidativer Stress in den Zellen aufgetreten ist 25. Die mRNA-Expressionen anderer antioxidativer Enzyme, einschließlich CAT, SOD1 und SOD2, wurden ebenfalls untersucht und alle waren in der H 2 -Gruppe unterdrückt, mit signifikanten Veränderungen bei CAT und SOD2. Die Unterdrückung von durch US-Exposition induzierter HO-1-, CAT- und SOD2-mRNA-Expressionen in der H 2 -Gruppe ( 4a , b, d ) zeigt an, dass die kornealen Endothelzellen durch H 2 vor oxidativen Angriffen bei der Phakoemulsifikation geschützt wurden. Schließlich zeigte die Immunhistochemie, dass die Zahl der 4-HNE- und 8-OHDG-positiven Zellen in der H 2 -Gruppe signifikant kleiner war ( 5 ), was histologisch beweist, dass der oxidative Schaden durch H 2 wirklich unterdrückt wurde .

Alle in der aktuellen Studie vorgelegten Beweise unterstützen nachdrücklich die Nützlichkeit von H 2 bei der Phakoemulsifikation. Unter den verschiedenen H 2 -Anwendungen in der Medizin, über die bisher berichtet wurde, kann in der Augenspüllösung gelöstes H 2 eine der vernünftigsten und vielversprechendsten Anwendungen von H 2 sein . In diesem System wird der Vorderkammer des Auges kontinuierlich H 2 zugeführt, wo ·OH durch US-Oszillation ohne irgendeinen zusätzlichen Eingriff wie Injektion oder Inhalation erzeugt wird. Die Wirkung von H 2 gegen ROS wurde auf verschiedene Weise in früheren Studien beschrieben 23. Obwohl die Wirkung in einem Ischämie-Reperfusions-Verletzungsmodus seit unserem ersten Bericht 15 , 20 , 26 , 27 als repräsentative Studie angesehen wurde , haben wir unter diesen auch die Wirkung von H 2 in einem strahleninduzierten Lungenschadensmodell 19 berichtet . Einer der schädlichen Effekte ionisierender Strahlung, dh die indirekte Wirkung, tritt auf, wenn ionisierende Strahlung mit Wassermolekülen in Zellen interagiert, was zur Produktion von ROS einschließlich ·OH führt. Die ROS reagiert schnell mit zellulären Makromolekülen, um DNA, Lipide und Proteine zu schädigen und starke zytotoxische Wirkungen auszuüben. Es wurde geschätzt, dass ·OH 60–70 % der durch ionisierende Strahlung verursachten Zellschäden verursacht 28. Das durch Sonolyse induzierte ·OH in der Phakoemulsifikation ist eine weitere Art der oxidativen Schädigung der Zellen und schien zumindest teilweise der durch Bestrahlung induzierten Schädigung ähnlich zu sein.

Die Standardzusammensetzung der Augenspüllösung enthält Glutathion, das ein bekanntes Antioxidans ist 29 , 30 . Obwohl die in der aktuellen Studie verwendete Lösung, das Ope Guard ® neo-Kit, Glutathion enthält, war die durch ESR und HPF gezeigte Produktion von ·OH offensichtlich. Allerdings zeigten die Ergebnisse von In-vivo -Experimenten deutlich mehr korneale Endothelschäden in der Kontrollgruppe als in der H 2 -Gruppe, was darauf hindeutet, dass Glutathion allein nicht ausreicht, um die Zellen in diesem Modell vor oxidativem Stress zu schützen, der durch US-Oszillation verursacht wird. Darüber hinaus haben mehrere Berichte die Wirkung von Ascorbinsäure als Antioxidans in einem In-vivo - Phakoemulsifikationsmodell gezeigt 31 .32 und in einem In-vitro - Modell 33 , es wurde jedoch noch keine klinische Studie zur Verwendung von Ascorbinsäure bei der Phakoemulsifikation durchgeführt. Dies kann daran liegen, dass Ascorbinsäure leicht zu Dehydroascorbinsäure oxidiert werden kann, was eine Wirkung auf Glutathion haben kann 33 . Insofern bestehen keine Bedenken hinsichtlich oxidativer Addukte bei H 2 -Einsatz. Da es buchstäblich keine Barriere für H 2 gibt, kann es darüber hinaus durch schnelle Diffusion entweder außerhalb oder innerhalb der Zellmembran wirken.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in der Augenspüllösung gelöstes H 2 die Endothelzellen der Hornhaut wirksam vor oxidativem Stress und Schäden durch Phakoemulsifikation schützte. In der Spüllösung gelöstes H 2 kann eine doppelte Wirkung haben: als direkter Scavenger gegen durch Sonolyse produziertes ·OH und als Antioxidans in der Zelle. Ersteres wurde in der aktuellen Studie durch die BSG- und HPF-Analysen eindeutig belegt. In In-vivo - Experimenten war die günstige Wirkung von H 2 offensichtlich, aber um die antioxidative Funktion von H 2 in Zellen eindeutig zu belegen, sind weitere Untersuchungen erforderlich.

Tiere

Neun Wochen alte männliche japanische weiße Kaninchen mit einem Gewicht von 2,5 bis 3,0 kg wurden von Tokyo Laboratory Animals Science Co. Ltd. (Tokio, Japan) gekauft. Die Tiere wurden einzeln unter standardisierten Laborbedingungen gehalten und mit Leitungswasser und Futter ad libitum versorgt . Alle Tiere wurden gemäß der ARVO-Erklärung zur Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung behandelt. Schweineaugen, die für H 2 -Konzentrationsmessungen verwendet wurden, wurden von einem örtlichen Schlachthof bezogen.

Herstellung einer in H 2 gelösten Spüllösung

Die Augenspüllösung wird verwendet, um die anatomische und physiologische Integrität des intraokularen Gewebes bei Augenoperationen, einschließlich Phakoemulsifikation, aufrechtzuerhalten. Die Standardzusammensetzung von im Handel erhältlichen Spüllösungen umfasst Glutathion, Glucose und Natriumbicarbonat, das sich als wirksam für die Aufrechterhaltung normaler Endothelfunktionen der Hornhaut erwiesen hat 29 . In der aktuellen Studie wurde das Kit Ope Guard ® neo (Senju Pharmaceutical, Osaka, Japan) verwendet, das die Standardbestandteile enthält. Das Ope Guard ® neo-Kit ist ein weiches Plastiktütenprodukt und eine der beliebtesten Bewässerungslösungen in Japan. H 2 auflösenin der Lösung wurde der Beutel in eine Vakuumkammer aus Acryl (SNS-Typ, Sanplatec, Osaka, Japan) gegeben, in der die Luft durch 100 % H 2 -Gas ersetzt wurde ( 1a ). Aufgrund seiner Molekülgröße dringt H 2 auch ohne Überdruck in der Kammer spontan durch die Kunststofffolie des Beutels. Der Beutel wurde nach 24-stündiger oder 1-wöchiger Exposition aus der Kammer entnommen, und die gelöste H 2 -Konzentration in der Lösung wurde sofort unter Verwendung eines Nadel-H 2 -Sensors (Unisense, Aarhus N, Dänemark) gemessen. Dann wurden enukleierte Schweineaugen verwendet, um Änderungen der H 2 -Konzentration in der Vorderkammer durch Spülung mit H 2 -gelöster Lösung zu beurteilen. Das H2 -Sensor wurde durch den Einschnitt eines enukleierten Schweineauges eingeführt und die H 2 -Konzentration wurde alle 5 Minuten für 30 Minuten unter kontinuierlicher Spülung der Lösung mit 10 ml/min gemessen ( 1b ). Um die O 2 -Versorgung des Gewebes zu bestätigen, wurde außerdem die O 2 -Konzentration in der Vorderkammer eines enukleierten Schweineauges 2 Minuten nach Beginn der Spülung auch unter Verwendung eines Nadel-O 2 -Sensors (Unisense) gemessen.

Nachweis von ·OH durch ESR

Der ·OH-Nachweis durch ESR wurde ähnlich wie in unserem vorherigen Papier 11 durchgeführt . Für das Spintrapping wurde eine 10%ige wässrige Lösung von 5,5'-Dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid (DMPO; Labotec, Tokio, Japan) verwendet. DMPO wurde der Ope Guard ® neo-Kit-Lösung in einer Endkonzentration von 1 % zugesetzt. In 50-ml-Plastikteströhrchen wurden 10 ml 1% DMPO/H 2 -gelöste Lösung (H 2 -Gruppe) oder normale Lösung (Kontrolle) hergestellt. Die US-Sonde eines kommerziell erhältlichen Phakoemulsifikationsgeräts ( Stellaris®, Bausch & Lomb, Rochester, NY) wurde in der Mitte des Röhrchens platziert und US wurde bei einem Leistungsniveau von 30 % für 10 Sekunden ohne Irrigation und Aspiration erzeugt. Unmittelbar nach US wurden 300 µl der Lösung in eine Flachquarz-ESR-Küvette überführt. Die Küvette wurde dann in ein ESR-Spektrometer (Modell JES-RE3X; JEOL, Tokio, Japan) gestellt und die Signale der Spinaddukte, DMPO-OH, wurden durch doppelte Integrationswellenhöhe unter Verwendung eines Computersoftwareprogramms (ES-IPEITS data Systemversion 7.0; JEOL). Alle Messungen wurden dreimal durchgeführt.

Nachweis von ·OH durch HPF

HPF ist ein neuartiges Reagenz, das bestimmte hochreaktive Sauerstoffspezies (hROS) 34 direkt nachweist . Obwohl HPF selbst wenig Fluoreszenz hat, reagiert es selektiv und dosisabhängig mit hROS, wie z. B. ·OH und Peroxynitrit, und zeigt starke Fluoreszenz. HPF (Goryo Chemical, Hokkaido, Japan) wurde zu einer in H 2 gelösten Lösung (H 2Gruppe) oder Normallösung (Kontrolle) bei einer Endkonzentration von 5 μM. Wie im ESR-Experiment wurde in 10 ml der Lösung in den 50-ml-Kunststoffteströhrchen eine US-Oszillation ohne Spülung und Absaugung für 10 Sekunden bei 30 % Leistung durchgeführt. Unmittelbar nach US wurde die Fluoreszenz der Proben mit einem Plattenlesegerät (Wallac 1420 ARVO; PerkinElmer, Waltham, MA) mit Anregung bei 485 nm und Emission bei 535 nm gemessen. Alle Messungen wurden 4 Mal durchgeführt.

Wirkungen von H 2 bei der Phakoemulsifikation in vivo

Kaninchen wurden durch intramuskuläre Injektion von Ketamin (30 mg/kg) und Xylazin (4 mg/kg) anästhesiert und topisches Oxybuprocainhydrochlorid (Santen Pharmaceutical, Osaka, Japan) wurde für die Lokalanästhesie verwendet. Die US-Sonde (Stellaris ® , Bausch & Lomb) wurde in die Mitte der Vorderkammer durch die Inzision eingeführt und dann eine kontinuierliche US-Oszillation unter Spülung mit H 2 -gelöster Lösung (H 2Gruppe) oder Normallösung (Kontrolle) wurde für 90 Sekunden bei 30 % Leistung der US-Einstellung des Geräts durchgeführt (Vakuumdruck: 175 mmHg; Flaschenhöhe: 85 cm). Um den Effekt der Sondenmanipulation zu vermeiden, wurde das Phakoemulsifikationsverfahren in beiden Gruppen auf völlig ähnliche Weise durchgeführt. Die US-Sonde wurde langsam auf der Irisebene rundherum bewegt, ohne die Linse zu berühren. 5 Stunden nach dem Eingriff wurden die Kaninchen durch eine Überdosis-Injektion von Ketamin eingeschläfert. Nachdem die vorderen Segmente unter Verwendung des ophthalmologischen Operationsmikroskops fotografiert worden waren, wurde die gesamte Hornhaut herausgeschnitten und den folgenden Experimenten unterzogen.

Bildanalyse von Hornhautödemen

Die ausgeschnittenen Hornhäute (Kontrolle n = 4, H 2 -Gruppe n = 3) wurden fotografiert und mit der ImageJ-Software (Version 1.44, NIH, Bethesda, MD) analysiert, wie zuvor beschrieben 35 , 36 . Jedes Bild wurde mit denselben Kameraeinstellungen für Verstärkung und Zeit aufgenommen, und die Pixelintensität wurde für 25.000 Pixel (500 × 500 Pixel) im Zentrum der Hornhaut analysiert. Die Hintergrundintensität wurde aus der unbehandelten Hornhaut berechnet und von jedem Bild subtrahiert.

Semiquantitative PCR für HO-1-, CAT-, SOD1- und SOD2-mRNA

Es ist bekannt, dass HO-1 eine wichtige Rolle beim Zellmembranschutz gegen verschiedene oxidative Belastungen spielt 25 . CAT, SOD1 und SOD2 sind auch entscheidend für den Abbau der schädlichen Endprodukte der oxidativen Phosphorylierung 37 . Die Wirkung von H2auf ihre mRNA-Expression im Hornhautendothel evaluiert. 5 Stunden nach US-Exposition wurde die Hornhaut herausgeschnitten und die Endothelzellen wurden sofort unter Verwendung eines stumpfen Skalpells abgekratzt. Gesamt-RNA wurde aus Hornhautendothelzellen extrahiert und einer reversen Transkription unterzogen, wobei Teile der resultierenden cDNA dann einer halbquantitativen Echtzeit-PCR (qPCR)-Analyse mit einem 7500 Fast Real-Time PCR System (Life Technologies, Tokio, Japan) unterzogen wurden ). Das Fast Real-Time PCR System wurde mit den folgenden Primern verwendet: für HO-1, 5′-CAGGTGACTGCCGAGGGTTTTA-3′ (vorwärts) und 5′-GGAAGTAGAGCGGGGCGTAG-3′ (rückwärts) 38; für CAT wurden 5'-CCCAATAGGAGACAAACTGA-3' (vorwärts) und 5'-ACTCTCTCCGGAATTCTCTC-3' (rückwärts) unter Verwendung der DNASIS Pro-Software (Hitachi Software Engineering Co., Ltd., Tokio, Japan) entworfen; für SOD1, 5′-GACGCATAACAGGACTGACCG-3′ (vorwärts) und 5′-AACACATCAGCGACACCATTG-3′ (rückwärts) 39 , für SOD2, 5′-TGACGGCTGTGTCTGTTGGT-3′ (vorwärts) und 5′-GCAGGTAGTAAGCGGTTCCC-3′ (rückwärts) 39 , für Kaninchen-Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-Gen, 5'-GCCCCTTCTTCTCGTGCAG-3' (vorwärts) und 5'-ATGGATCATTGATGGCGACAACAT-3' (rückwärts) (Zugangsnummer L23961) 40. Das Zyklusprotokoll umfasste eine Inkubation bei 90 °C für 10 s, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 5 s und 60 °C für 34 s. Die relative Genexpression wurde unter Verwendung der Standardkurvenmethode berechnet. Die HO-1-mRNA-Spiegel wurden auf die des Housekeeping-GAPDH-Gens normalisiert. Das HO-1/GAPDH-Verhältnis in unbehandelten Hornhautendothelzellen wurde als 1,0 definiert. Um den Durchschnittswert des HO-1/GAPDH-Verhältnisses zu bestimmen, wurden 5 Messungen durchgeführt. Jede Probe wurde doppelt durchgeführt und jede Echtzeit-PCR wurde dreimal wiederholt (Kontrolle n = 7, H 2 -Gruppe n = 6).

Immunhistochemie

Die herausgeschnittenen Hornhäute wurden in Bouin-Lösung (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) für 1 Stunde bei 4 °C fixiert, dreimal für jeweils 10 Minuten in PBS mit 1 % Triton X-100 (Bio-Rad Laboratories, CA) gewaschen. (PBST) und 3 Minuten bei −20 °C mit Aceton behandelt. Sie wurden weiter dreimal für 10 Minuten mit PBST gewaschen und in 10 % Pferdeserum, verdünnt in PBST, inkubiert, um eine unspezifische Färbung zu blockieren. Die Hornhäute wurden dann in einer 1:30-Verdünnung eines monoklonalen Antikörpers gegen 8-OHdG (Kontrolle n = 5, H 2 -Gruppe n = 6) oder 4-Hydroxy-2-nonenal (4-HNE) (Kontrolle n = 3) inkubiert , H2Gruppe n = 5) über Nacht bei 4 °C (18). Beide Antikörper wurden vom Japan Institute for the Control of Aging (Shizuoka, Japan) bezogen. Die Hornhäute wurden dreimal 10 Minuten lang mit PBST gewaschen und mit biotinyliertem Pferde-Anti-Maus-IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Gewebe wurden dann dreimal 10 Minuten lang mit PBST gewaschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit ABC-Reagenz (Vector Laboratories) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBST für 10 Minuten wurden die Hornhäute mit DAB-Lösung (Vector Laboratories) für 10 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt. Abschließend wurden sie jeweils 5 Minuten mit destilliertem Wasser gewaschen und auf Objektträger aufgezogen.

Statistiken

Morphometrische Daten aus verschiedenen Regionen in jedem Auge wurden gemittelt, um einen Wert pro Auge bereitzustellen. Der Mittelwert und die SD für diese Messungen wurden für jede Gruppe berechnet und Vergleiche zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung des ungepaarten t - Tests (Stat Flex ver. 6, Artec, Osaka, Japan) durchgeführt. Ein p -Wert von < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Studienzulassung

Dieses Experiment wurde vom Animal Care and Use Committee der Nippon Medical School (27–045) genehmigt.

Zitieren dieses Artikels : Igarashi, T. et al . Wasserstoff verhindert Endothelschäden der Hornhaut bei der Kataraktchirurgie durch Phakoemulsifikation. Wissenschaft. Repräsentant _ 6 , 31190; doi: 10.1038/srep31190 (2016).

Diese Arbeit wurde teilweise durch Grant-in-Aid for Scientific Research (c) (26462670 und 26462650) des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie unterstützt. Die Autoren danken Dr. Kazuhira Takahashi für die Herstellung der H 2 -Augenspüllösung und Dr. Yasuhiro Terasaki für die Vorbereitung des ESR-Experiments.

Zugehörigkeiten

1. Abteilung für Augenheilkunde, Nippon Medical School 1-1-5 Sendagi, Bunkyo-ku, 113-8602, Tokio, Japan

   Tsutomu Igarashi, Maika Kobayashi und Hiroshi Takahashi

2. Biological Process of Aging, Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology, 35-2 Sakae-cho, Itabashi-ku, 173-0015, Tokyo, Japan

   Ikuroh Ohsawa & Masumi Iketani

3. Abteilung für Pädiatrie, Nippon Medical School 1-1-5 Sendagi, Bunkyo-ku, 113-8602, Tokio, Japan

   Toru Igarashi

4. Abteilung für Augenheilkunde, Nippon Medical School Musashikosugi Hospital, 1-396 Kosugi-cho, Nakahara-ku, Kawasaki City, 211-8533, Kanagawa, Japan

   Hisaharu Suzuki

Beiträge

Tsutomu I. entwarf das Projekt, führte Experimente durch und schrieb das Manuskript. MK und MI führten Experimente durch. Toru I. führte eine statistische Analyse durch. HS führte die Kaninchenoperationen durch. IO und HT konzipierten und überwachten das Projekt, beschafften Fördermittel und verfassten das Manuskript.

Konkurrierende Interessen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

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