Die Dämpfung von Zigarettenrauch induzierten Atemwegs-schleimproduktion von wasserstoffreichen Salzlösung bei Ratten
Studie aus 2013 Original Studie: http://www.molecularhydrogenstudies.com/attenuation-of-cigarette-smoke-induced-airway-mucus-production-by-hydrogen/
Ning Y, Shang Y, Huang H, et al.
Überproduktion von Schleim ist ein wichtiges pathophysiologisches Merkmal bei chronischen Atemwegserkrankungen wie chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD) und Asthma. Das Rauchen von Zigaretten (CS) ist die häufigste Ursache für COPD. Oxidativer Stress spielt eine wichtige Rolle bei der CS-induzierten abnormen Atemwegs - Schleimproduktion. Molekularer Wasserstoff schützt die Zellen und das Zellgewebe vor oxidativen Schäden durch das Neutralisieren der Hydroxylradikale. In der vorliegenden Arbeit untersuchten die Autoren die Wirkung von molekularem Wasserstoff auf CS-induzierte Schleimproduktion bei Ratten. Männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden in vier Gruppen eingeteilt: Scheinkontrolle, CS Gruppe, eine gruppe in der sie mit wasserstoffreiche Salz vorbehandelt wurden und eine wasserstoffreiche Salzkontrollgruppe. Lungenmorphologie und biochemische Gewebeveränderungen wurden durch Immunhistochemie, Alcianblau / Periodsäure-Schiff-Färbung, TUNEL, Western Blot und Echtzeit-RT-PCR bestimmt.. Bei der Gruppe der Wasserstoff-reichen Salzvorbehandlung wurde die CS-induzierte Schleimansammlung in den bronchiolar Lumen gedämpft, Becherzellen-Hyperplasie, MUC5AC Überexpression und abnorme Zell-Apoptose im Luftwegsepithel sowie Malondialdehyd qwurden im BALF erhöht. Die Phosphorylierung von EGFR bei Tyr1068 und Nrf2 Hochreguierungsexpression in den Rattenlungen von CS Exposition behindert wurden, sind auch von wasserstoffreichen Salz außer Kraft gesetzt worden. Wasserstoff-reiche Salz Vorbehandlung lindert CS-induzierten Atemwegsschleimproduktion und Luftwegsepithel Schäden bei Ratten. Die schützende Rolle von molekularem Wasserstoff auf CS-exponierten Ratten-Lunge wurde zumindest teilweise druch die freien Radikalen abfangenden Fähigkeit erreicht. Dies ist der erste Bericht, der den Schutz der Atemwege gegen CS Schaden durch die intraperitoneale Verabreichung von wasserstoffreichem Salz bei den Atemwegen von Ratten nachzuweist und es könnte bei der Behandlung von abnormen Atemwegsschleimproduktion in COPD vielversprechend sein.
Das Einatmen von Wasserstoffgas schützt vor der durch Zigarettenrauch verursachten COPD-Entwicklung bei Mäusen
Einführung
Chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist die vierthäufigste Todesursache weltweit ( 1 ) und verursacht eine erhebliche wirtschaftliche und soziale Belastung ( 2 ). Zigarettenrauchen ist der häufigste Risikofaktor für COPD. Es wurde ein starker Zusammenhang zwischen kontinuierlichem Tabakkonsum, oxidativem Stress und einer Verschlechterung der COPD-Symptome festgestellt ( 3 ). Zigarettenraucher haben eine höhere Prävalenz von Atemwegsbeschwerden, Lungenfunktionsstörungen und COPD-Sterblichkeitsraten als Nichtraucher ( 4)). Derzeit wird die medikamentöse COPD-Therapie eingesetzt, um Symptome zu lindern, die sportlichen Fähigkeiten und den Gesundheitszustand zu verbessern sowie die Häufigkeit und Schwere der Exazerbation zu verringern. Es ist jedoch keine pharmazeutische Therapie für COPD bekannt, die eine Abnahme der Lungenfunktion umkehren kann ( 5 - 8 ). Daher ist es notwendig, neue und wirksame Medikamente zu entwickeln, um COPD mit weniger Nebenwirkungen zu verhindern oder zu behandeln.
Es wurde gezeigt, dass H 2 , ein physiologisch regulierendes Gasmolekül, entzündungshemmende ( 9 ), antioxidative ( 10 ), antiapoptotische ( 11 ) und signalregulierende Wirkungen ausübt ( 12 ). Wasserstoffgas kann direkt mit Hydroxylradikalen (· OH) reagieren, was zu seinen entzündungshemmenden und antioxidativen Läsionen beitragen kann. Klinische Studien haben bestätigt, dass H 2 zur Behandlung von zerebraler Ischämie, Urämie ( 13 ), Diabetes ( 14 ), metabolischem Syndrom ( 15 ), Erythem-Hauterkrankungen, Druckgeschwüren, bösartigen Erkrankungen, Rheuma und Arthritis eingesetzt werden kann ( 16 , 17)), Nebenwirkungen im Zusammenhang mit Tumorstrahlentherapie und Chemotherapie ( 18 ), mitochondrialer Muskelkrankheit und Parkinson-Krankheit ( 19 ). Darüber hinaus kann das Einatmen von H 2 oder die Aufnahme von H 2 -reichem Wasser eine akute Lungenverletzung bei Mäusen, die durch Sauerstoffvergiftung, Beatmungsverletzung, Ischämie-Reperfusionsverletzung oder Sepsis hervorgerufen wird, wirksam verhindern ( 20 , 21 ). H 2 -reiche Kochsalzlösung schwächt auch die durch Zigarettenrauch (CS) induzierte Atemwegsschleimproduktion bei Ratten ab ( 22 ). Xiao et al. berichteten, dass H 2gesättigtes Wasser reduzierte die Umgestaltung der Atemwege und die Hypersekretion des Atemwegsschleims, indem es die Aktivierung von NF-κB bei asthmatischen Mäusen reduzierte ( 23 ). Die Inhalation von H 2 schwächte die Lungenentzündungsreaktionen bei CS-induzierter COPD bei Ratten ab. Darüber hinaus zeigten höhere Konzentrationen von H 2 ein besseres Ergebnis als niedrigere Konzentrationen von H 2 ( 24 ). Diese Befunde weisen stark darauf hin, dass H 2Behandlung kann bei der Behandlung von COPD vorteilhaft sein. In der vorliegenden Studie verwendeten wir ein Mausmodell der COPD mit CS-Exposition und bewerteten die Auswirkungen von Wasserstoffgas auf die Entwicklung der COPD. Wir untersuchten auch die Auswirkungen der Exposition gegenüber Wasserstoffgas auf die Aktivierung von ERK1 / 2- und NF-κB-abhängigen Entzündungsreaktionen, die durch Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) in menschlichen Bronchialepithelzellen induziert werden.
Methoden
Reagenzien
Alle Zellkulturreagenzien wurden von Gibco (Carlsbad, CA, USA) gekauft. Massons Trichrom-Färbekit (HT15), Cell Counting Kit-8 [96992] und H 2 O 2 -Lösung (7722-84-1) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) erhalten. Das Periodsäure-Schiff (PAS) -Kit wurde von Shanghai Sun Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Der β-Actin-Antikörper (sc-47778) wurde von Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA) erhalten. Der NF-κB (ab32536) -Antikörper wurde von Abcam (Cambridge, UK) erhalten. Antikörper gegen ERK1 / 2 (Nr. 4695), phosphoryliertes ERK1 / 2 (Nr. 8544) und Histon H3 (Nr. 9728) wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) erhalten.
Tiere und CS Exposition
Männliche Wildtyp-C57BL / 6J-Mäuse (6–8 Wochen alt) wurden vom Nanjing BioMedical Research Institute der Universität Nanjing (Nanjing, China) gekauft. Die Tiere wurden in den spezifischen Einrichtungen ohne Krankheitserreger gehalten, und das Animal Care and Use Committee der Guangzhou Medical University genehmigte alle Versuchsprotokolle. Alle Methoden wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die vom Animal Care and Use Committee der Guangzhou Medical University genehmigt wurden. Die Tiere wurden in die folgenden drei Gruppen randomisiert: Kontrollgruppe (CTL, normale Lufteinatmung ohne CS-Exposition), CS-Exposition (CS), CS-Exposition und H 2 -Inhalation (CS + H 2)). Um das COPD-Mausmodell zu etablieren, wurden Mäuse 90 Tage lang CS (9 Zigaretten / h, 2 h pro Exposition, zweimal pro Tag, 6 Tage pro Woche) in einer Ganzkörper-Expositionskammer ausgesetzt, wie wir zuvor beschrieben haben ( 25 , 26 ). Die in dieser Studie verwendeten Zigaretten waren die Marke Plum, hergestellt von Guangdong Tobacco Industry Co., Ltd. (Guangzhou, China). Jede Zigarette ergibt 11 mg Teer, 1,0 mg Nikotin und 13 mg Kohlenmonoxid (CO). Für die H 2 -Behandlung wurden die Mäuse nach 60-tägiger CS-Exposition mit H 2 behandelt . H 2 und Sauerstoff (O 2 ) wurden durch Elektrolyse von entionisiertem Wasser mit einer H 2 -Apparatur (Shanghai Asclepius Meditech, Shanghai, China) erzeugt. Frische Mischung von H 2(66,7%) und O 2 (33,3%) Gase wurden mit Stickstoff (N 2 ), getrennt von Luft, zu einer Mischung verdünnt , die H 2 (42%), O 2 (21%) und N 2 (37%) enthielt, und abgegeben durch einen Gummischlauch mit einem Fluss von 3,8 l / min zu den CS-exponierten Mäusen, die in eine versiegelte Kammer gebracht wurden, die durch ein Loch mit der Außenluft verbunden ist. Die H 2 -Inhalation wurde eine Stunde pro Sitzung zweimal täglich im Abstand von 6 bis 8 Stunden durchgeführt. Die Mäuse in der Kontrollgruppe wurden in die versiegelte Kammer gegeben und mit Luft versorgt. Die Konzentrationen von H 2 , O 2 und CO 2in der Kammer wurden zu Beginn und am Ende jeder Inhalation überwacht, um die Stabilität jeder Luftkomponente sicherzustellen. Die Tiere wurden dann vor der Dissektion zur weiteren Analyse am Tag 91 einer Lungenfunktionsbewertung unterzogen.
Lungenfunktionsmessung
Die Lungenfunktion wurde unter Verwendung eines erzwungenen Lungenmanöversystems (Buxco Research Systems, Wilmington, NC, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen, wie wir es zuvor beschrieben haben ( 25 ).
Hämatokritmessung
Am Ende der chronischen CS-Exposition wurde der Hämatokrit nach der zuvor beschriebenen Methode gemessen ( 25 ).
Sammlung und Zählung der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF)
Jede Mauslunge wurde dreimal mit 0,6 ml Kochsalzlösung gespült. Die Gesamtzellen in BALF wurden gesammelt und unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt. Die Zellen wurden dann einer Giemsa-Färbung zur Differenzialzählung von Neutrophilen, Makrophagen und Lymphozyten unter einem Mikroskop unterzogen.
Histologische Färbung und morphologische Analyse
Nach dem Töten wurden die linken Lungen von Mäusen 24 Stunden lang in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert und dann dehydratisiert und in Paraffin eingebettet. Die Proben wurden in 4 & mgr; m-Schnitte geschnitten und zur histologischen Untersuchung mit H & E gefärbt. Lungenschnitte wurden mit PAS gefärbt, um die Becherzelldichte oder Massons Trichromfärbung für die Kollagenablagerung mit kommerziellen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen. Die Vergrößerung und Zerstörung der Alveolen wurde durch den zuvor beschriebenen durchschnittlichen linearen Achsenabschnitt bestimmt ( 27)). Die Software Image-Pro Plus Version 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) wurde verwendet, um den mittleren linearen Achsenabschnitt zu bestimmen, der das Verhältnis der Gesamtlänge der Alveolen zur Anzahl der Alveolen pro Feld unter Lichtmikroskopie widerspiegelte. In ähnlicher Weise zur Quantifizierung der Kollagenablagerung in den kleinen Atemwegen gemäß einem zuvor beschriebenen Protokoll ( 28) verwendeten wir Bilder aller Atemwege mit einem Durchmesser von 50–499 µm in der Lunge, einschließlich der blauen Schicht außerhalb des Atemwegs, der Schicht aus abgelagertem Kollagen, da größere Atemwege bei CS-exponierten Mäusen nicht mit einer erhöhten Kollagenablagerung verbunden sind . Die Fläche der Kollagenschicht, die sich um kleine Atemwege ablagert, wurde wie folgt berechnet: Kollagendicke = Kollagenfläche / Gesamtbronchialfläche. Semiquantitative Analysen der flächengefärbten positiven Fläche für Becherzellen im Atemwegsepithel wurden mit Image-Pro Plus definiert. Es wurden mindestens drei Felder pro Maus verwendet.
Zellkultur und Behandlung
16HBE wurden von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) gekauft und in DMEM-Medium, das 10% FBS, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin enthielt, in einem angefeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 95% kultiviert (v / v) Luft und 5% (v / v) CO 2 . Zur Behandlung mit H 2 O 2 plus H 2 wurden 16HBE-Zellen in 6-Well-Platten bei 60 bis 70% Konfluenz ausgesät, dann wurden die Zellen 12 Stunden lang an Serum gehungert und 1 Stunde lang H 2 (42%) ausgesetzt vor 24 h Behandlung mit H 2 O 2(0,1 mM) in 2 ml Medium, das 1% FBS enthält. Nach all diesen Behandlungen wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, die Zelllysate wurden für die Western-Blot-Analyse geerntet. Der Überstand wurde zum Nachweis der proinflammatorischen Zytokine bei –80 ° C gelagert.
Zelllebensfähigkeitstest
Die Lebensfähigkeit von 16HBE-Zellen nach H 2 O 2 -Behandlung wurde unter Verwendung eines CCK8-Assay-Kits (Sigma, USA) bestimmt. Die Zellen (5.000 Zellen / Vertiefung ) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät, die 24 Stunden lang mit H 2 O 2 (0–0,8 mM in Medium, das 1% FBS enthielt) behandelt wurden. Anschließend wurden weitere 2 Stunden lang 10 & mgr; l CCK8-Lösung in jede Vertiefung gegeben. Schließlich haben wir die Extinktion bei 450 nm unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Extinktionslesegeräts (Thermo Scientific, MA, USA) aufgezeichnet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Prozentsatz der Zellen ohne H 2 O 2 -Behandlung angegeben.
Herstellung von Kernproteinextrakten
Kernproteine aus Lungengeweben oder 16HBE-Zellen wurden unter Verwendung der NE-PER-Kern- und Zytoplasma-Reagenzien (Thermo Fisher Scientific) extrahiert, die einen Proteaseinhibitor-Cocktail gemäß den Anweisungen des Herstellers enthielten. Histon H3 diente als Beladungskontrolle beim Western Blot von Kernproteinen.
Western Blot
Mauslungengewebe und -zellen wurden in RIPA-Lysepuffer homogenisiert, der 1% Proteaseinhibitorcocktail (Sigma-Aldrich), 5 uM EDTA und 200 uM 4- (2-Aminoethyl) benzolsulfonylfluoridhydrochlorid enthielt, um das Gesamtprotein zu extrahieren. Gleiche Mengen an Protein in Homogenatproben wurden in SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) aufgetrennt und mit Primärantikörpern und entsprechenden Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpern geblottet. Das gebundene Antikörpersignal wurde unter Verwendung eines Immun-Star HRP-Chemilumineszenz-Kits (Bio-Rad Laboratories) entwickelt. Das Western-Blot-Bild wurde mit dem Chemonumineszenz-Bildgebungssystem Tanon 5200 (Shanghai Tanon Science & Technology, Shanghai, China) erhalten. Semiquantitative Analysen von Immunblots wurden unter Verwendung des Bildes J durchgeführt.
Enzymgebundener Immunosorbens-Assay (ELISA)
Die Spiegel von Interleukin (IL) -6, Keratinozyten-Chemoattraktant (KC), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), IL-8, Muc5ac und Muc5b in BALF oder in Zellkulturmedium wurden durch ELISA gemessen. Kurz gesagt wurden menschliches oder Maus-IL-6 (88-7066 / 88-7064), Maus-TNF-α (88-7324) und menschliches IL-8 (88-8086) unter Verwendung der ELISA-Kits von eBioscience (San Diego, gemessen). CA, USA) gemäß den Protokollen des Herstellers. KC in BALF wurde mit ELISA unter Verwendung von Einfang- und Nachweisantikörpern nachgewiesen, die von R & D Systems (Minneapolis, MN, USA) gemäß einem zuvor beschriebenen Protokoll ( 29 ) erhalten wurden. Muc5ac und Muc5b in BALF wurden ebenfalls wie zuvor beschrieben nachgewiesen ( 30). Die Einfangantikörper für Muc5ac (sc-21701) und Muc5b (sc-135508) wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) erhalten, und der entsprechende Nachweisantikörper wurde von KPL, Inc. (Gaithersburg, MD, USA) erhalten. Das Signal wurde unter Verwendung eines TMB-Substratreagenzien-Sets (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) entwickelt.
statistische Analyse
Die Daten wurden mit der Graphpad Prism 5-Software verarbeitet und als Mittelwert ± SEM dargestellt. Im Tierversuch steht "n" für die Tierzahl, während im Zellversuch "n" für die Anzahl der wiederholten Versuche steht. Die Signifikanz des Unterschieds zwischen den Gruppen wurde durch Einweg-ANOVA- und Bonferroni-Holms-Test bewertet. P <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Ergebnisse
Die Inhalation von H 2 vermindert die CS-induzierte Abnahme der Lungenfunktion bei Mäusen
COPD-Mäuse wurden durch 90-tägige CS-Exposition hergestellt ( Fig. 1A ). Im Vergleich zu Kontrollmäusen mit normaler Lufteinatmung zeigten die CS-exponierten Mäuse einen typischen COPD-ähnlichen Lungenfunktionsabfall ( 1B, C, D, E, F, G ), der durch Erhöhungen der FRC, der Gesamtlungenkapazität (DC) und der Akkordkonformität angezeigt wird (Cchord), FVC und Widerstand (RI) sowie eine Abnahme des FEV50 / FVC-Verhältnisses. Obwohl der Unterschied zwischen FVC und RI zwischen der CS-Gruppe und der CS + H 2 -Gruppe nicht signifikant ist, wurden CS-verursachte Erhöhungen von FRC, DC, Cchord und Abnahme der FEV50 / FVC durch H 2 -Inhalation abgeschwächt . Wie in 1H gezeigt , erhöhten CS-Expositionen den Hämatokritwert im Blut signifikant, was durch H 2 verbessert wurdeVerwaltung. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Inhalation von H 2 die CS-induzierte Abnahme der Lungenfunktion der Maus und die durch Hypoxie induzierte Erhöhung des Hämatokrits verbessert.
Die Inhalation von H 2 inhibierte die CS-induzierte Abnahme der Lungenfunktion bei Mäusen. (A) C57BL / 6J-Mäuse wurden 90 Tage lang CS ausgesetzt. Die Mäuse wurden dann mit Vehikel oder 42% H 2 behandelt und einer Lungenfunktionsbewertung unterzogen; (B, C, D, E, F, G) Lungenfunktionsparameter, funktionelle Restkapazität (FRC), gesamte Lungenkapazität (DC), Akkord-Compliance (Cchord), erzwungene Vitalkapazität (FVC), Widerstandsindex (RI), und das FEV50 / FVC-Verhältnis wurden gemessen; (H) Hämatokrit, ein Indikator für chronische Hypoxie, wurde gemessen. Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM, n = 10 in der CTL-Gruppe, n = 8 in der CS-Gruppe, n = 8 in der CS + H 2 -Gruppe. *, P <0,05; **, P <0,01.
Die Inhalation von H 2 vermindert das CS-induzierte Emphysem, die Kollagenablagerung in den kleinen Atemwegen und die Becherzellhypertrophie sowie die Hyperplasie des Atemwegsepithels
Fig. 2A zeigte eine typische pathologische Darstellung von COPD, wie beschädigte Alveolarwände und Lungenbullae, in Mäuselungen, die CS ausgesetzt waren. Das Einatmen von H2reduzierte die strukturelle Schädigung der Lunge und die Ansammlung von Leukozyten sowohl in den Alveolarwänden als auch in den Räumen signifikant. Becherzellen aus dem Atemwegsepithel von CS-exponierten Mäusen, die durch PAS-Färbung identifiziert wurden, enthielten große körnige Speicher von PAS-positiven Substanzen, die in der H2-Behandlungsgruppeabgeschwächt wurden(2B ). Die Blaufärbung zeigte bei CS-exponierten Mäusen eine starke Kollagenablagerung im kleinen Atemweg (50–499 µm Durchmesser), und diese Effekte wurden durch H2-Inhalation verringert(Abbildung 2C ). Diese Ergebnisse legen nahe, dass H.2 Inhalation verbessert CS-induzierte COPD-pathologische Veränderungen in der Mauslunge.
Die H 2 -Inhalation schwächte das CS-induzierte Emphysem, die Kollagenablagerung in den kleinen Atemwegen und die Becherzellhypertrophie sowie die Hyperplasie des Atemwegsepithels ab. Vergleich der H & E- oder Masson- oder PAS-Färbung von Maus-Lungenschnitten von mit Kontrolle (CTL), CS und CS plus H 2 (CS + H 2 ) behandelten Mäusen. Die Software IPP6.0 wurde verwendet, um den durchschnittlichen linearen Achsenabschnitt (Lm) von Alveolen (A), Becherzellhyperplasie (B) und Umbau kleiner Atemwege (C) in mindestens drei Feldern des Lungenabschnitts pro Maus zu bestimmen. Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM, n = 5 in jeder Gruppe. *, P <0,05; **, P <0,01.
Die Inhalation von H 2 reduziert die CS-induzierte Entzündung der Atemwege und die Schleimhypersekretion bei COPD-Mäusen
Fig. 3A, B, C, D zeigten, dass die CS-Exposition zu einer Entzündung der Atemwege und der Lunge führte, was durch einen Anstieg der Gesamtleukozytenzahl (dh Neutrophile, Makrophagen und Lymphozyten) und höhere Spiegel von IL-6, TNF-α und KC angezeigt wurde in BALF. DieBehandlung mitH2schwächte diese Effekte ab. Die Spiegel von Muc5ac und Muc5b waren in BALF aus der CS-exponierten Gruppe im Vergleich zu Kontrollmäusen signifikant erhöht, was durch H2-Behandlungsignifikant verringert wurde(3E, F ). Diese Ergebnisse zeigen, dass die H2-Inhalation die CS-induzierte Atemwegsentzündung und die Schleimhypersekretion bei COPD-Mäusen abschwächt.
Die H 2 -Inhalation reduzierte die CS-induzierte Atemwegsentzündung und die Schleimhypersekretion bei COPD-Mäusen. Vergleich der Gesamtzellzahl (assoziiert mit Neutrophilen, Makrophagen und Lymphozyten) (A) und der Spiegel von IL-6 (B), TNF-α (C) und KC (D) in BALF aus Kontrolle (CTL), CS und Mit CS plus H 2 (CS + H 2 ) behandelte Mäuse. Vergleich des Spiegels von Muc5ac (E) und Muc5b (F) in BALF von mit Kontrolle (CTL), CS und CS plus H 2 (CS + H 2 ) behandelten Mäusen. Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM, n = 10 in der CTL-Gruppe, n = 8 in der CS-Gruppe, n = 8 in der CS + H 2 -Gruppe, *, P <0,05; **, P <0,01.
H 2 verringert die H 2 O 2 -induzierte proinflammatorische Zytokinfreisetzung in menschlichen Bronchialepithelzellen
Unter der Exposition von 42% H 2 stieg die Konzentration von H 2 im Zellkulturmedium mit der Expositionszeit allmählich an, und die H 2 -Konzentration im Zellkulturmedium war nach 60 Minuten gesättigt (445 ± 36 ppb) ( 4A ). H 2 O 2, ein wichtiger Faktor, der oxidativen Stress induziert, ist im abgelaufenen Atemkondensat von COPD-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen erhöht ( 31 ). Daher untersuchten wir die entzündungshemmenden und antioxidativen Fähigkeiten von H 2 gegen H 2 O 2 -induziert oxidative Schädigung in menschlichen Bronchialepithelzellen (16HBE). Nach Inkubation der Zellen mit H 2 O.2 für 24 h bei Konzentrationen von 0,1, 0,2, 0,4 und 0,8 mM beobachteten wir eine konzentrationsabhängige Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen ( 4B ). Während hohe Konzentrationen von H 2 O 2 (0,2–0,8 mM) die Lebensfähigkeit der Zellen verringerten, verringerte eine niedrigere Konzentration von H 2 O 2 (0,1 mM) nicht die Lebensfähigkeit der Zellen, sondern erhöhte die Freisetzung von IL-6 und IL-8 in den Kulturüberstand ( Fig. 4C, D ). Im Überstand von mit H 2 vorbehandelten 16HBE-Zellen wurden jedoch geringere IL-6- und IL-8- Spiegel beobachtet als in der H 2 O 2 -Gruppe. Diese Befunde legen nahe, dass die H 2 -Behandlung H 2 verhinderteO 2 -induzierte proinflammatorische Zytokinfreisetzung aus 16HBE-Zellen.
H 2 verringerte die H 2 O 2 -induzierte proinflammatorische Zytokinfreisetzung in 16HBE-Zellen. 16HBE-Zellen wurden mit H 2 O 2 (0,1 mM) mit oder ohne H 2 (42%) Exposition für 2 Stunden behandelt , (A) die H 2 -Konzentration im Zellkulturmedium wurde gemessen. 16HBE-Zellen wurden mit H 2 O 2 (0,1 mM) mit oder ohne H 2 (42%) Exposition 24 Stunden lang behandelt ; (B) die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung des CCK8-Assays gemessen; (C, D) Spiegel von IL-6 und IL-8 in Zellkulturmedium wurden gemessen. Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM, nC = 5 in jeder Gruppe, **, P <0,01.
Die Inhalation von H 2 reduziert die Aktivierung von ERK1 / 2 und NF-kB in CS-exponierten Mäuselungen und H 2 O 2 -behandelten 16HBE-Zellen
Oxidativer Stress und Entzündungen spielen eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese der COPD. MAPKs und NF-κB-Signalwege spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der CS-induzierten Sekretion entzündungsfördernder Mediatoren ( 32 - 34 ). Um weiter aufzuklären, wie H 2 die CS-induzierte Entzündung moduliert, haben wir die Wirkung von ERK1 / 2 und NF gemessen -κB im Lungengewebe. Wie in 5A gezeigt , waren die Phosphorylierung von ERK1 / 2 und die intranukleäre Akkumulation von NF-κB im Lungengewebe der CS-Gruppe bemerkenswert erhöht. Die Behandlung mit H 2 reduzierte diese Spiegel signifikant. In 16HBE-Zellen beobachteten wir, dass die ERK1 / 2-Phosphorylierung und die Kernakkumulation von NF-κB bei Behandlung mit H 2 O 2 signifikant erhöht warenwährend die Vorbehandlung mit H 2 diese molekularen Veränderungen abschwächte ( 5B ). Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass H 2 vor CS und durch oxidativen Stress induzierter Aktivierung der NF- & kgr; B- und MAPK-Signalwege schützt.
Die Inhalation von H 2 schwächte die Aktivierung von ERK1 / 2 und NF-κB in CS-exponierten Mäuselungen und mit H 2 O 2 behandelten 16HBE-Zellen ab. (A) Spiegel von phosphoryliertem ERK1 / 2 in cytosolischen Proteinfraktionen und NF-κB / p65 in Kernproteinfraktionen aus Lungengewebe von Mäusen. Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM, n = 4 in jeder Gruppe, **, P <0,01; (B) 16HBE-Zellen wurden 1 h mit Wasserstoffperoxid (0,1 mM) mit oder ohne 1 h H 2 -Vorbehandlung behandelt . Die Gehalte an phosphoryliertem ERK1 / 2 in cytosolischen Proteinfraktionen und NF-κB / p65 in Kernproteinfraktionen aus 16HBE-Zellen wurden bestimmt. Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM, n = 3 in jeder Gruppe, **, P <0,01.
Diskussion
COPD ist weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität ( 1 , 35 ). Der Hauptrisikofaktor für COPD ist Tabakrauch, einschließlich der Exposition gegenüber Passivrauch ( 36 ). In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass das Einatmen von hochkonzentriertem Wasserstoffgas die Abnahme der Lungenfunktion und die durch CS-Exposition verursachten histopathologischen Veränderungen der COPD verbessert, einschließlich Lungenemphysem, chronischer Bronchitis und Umbau kleiner Atemwege. Diese histopathologischen Veränderungen führen zu Gaseinschluss und fortschreitender Luftstrombegrenzung. Die Schutzfunktion von H 2in CS-exponierten Mäuselungen ist zumindest teilweise auf seine entzündungshemmenden und antioxidativen Aktivitäten zurückzuführen. Die CS-induzierte Phosphorylierung von ERK1 / 2 und die nukleare Akkumulation von NF-κB in der Lunge wurden durch H 2 -Behandlung aufgehoben . Weiterhin H 2 -Schutz gegen H 2 O 2 -induzierte ERK1 / 2- und NF-κB-abhängige Entzündungsreaktionen in 16HBE-Zellen. Basierend auf unseren Erkenntnissen ist H 2 ein potenzielles Medikament zur COPD-Prävention, das bequem durch Inhalation verabreicht werden kann.
In dieser Studie wurde das Mausmodell durch CS-Exposition etabliert, eine Methode, die die Entwicklung der menschlichen COPD nachahmt. Eine durch CS induzierte Entzündung ist ein kritischer Faktor bei der Krankheitsentwicklung. Das Einatmen von CS löst akute und chronische Entzündungsreaktionen aus, die möglicherweise eine Zerstörung der Alveolen verursachen können. Sobald eine Schädigung des Lungengewebes vorliegt und der Patient Schwierigkeiten beim Atmen hat. Die Raucherentwöhnung kann weitere Lungenschäden nicht signifikant verhindern ( 37 ). Die Mechanismen für diese verstärkte Entzündung sind noch nicht vollständig verstanden. Oxidativer Stress in der Lunge löst wahrscheinlich eine weitere Entzündung bei COPD aus ( 37 - 39). Selbst mit den gegenwärtigen entzündungshemmenden Medikamenten fällt es uns schwer, Atemwegsentzündungen zu kontrollieren. Im Gegensatz zu den langwirksamen Bronchodilatatoren ist es nicht einfach, eine sichere und wirksame entzündungshemmende Behandlung von COPD zu finden ( 40 ). Bisher gibt es keine Behandlungen, um chronische Entzündungen bei COPD wirksam zu hemmen.
Jüngste Studien haben gezeigt, dass H 2 eine neue Art von medizinischem Behandlungsgas mit antioxidativen und entzündungshemmenden Eigenschaften ist, indem es die Sekretion von entzündlichen Zytokinen wie IL-6 und TNF-a und einigen phosphorylierenden Signalfaktoren lindert ( 41 , 42 ). Die Zugabe von H 2 zu Hämodialyselösungen verbesserte Entzündungsreaktionen durch Verringerung der Spiegel von MCP-1 und Myeloperoxidase im Plasma von Hämodialysepatienten ( 13 ), was den potenziellen therapeutischen Effekt zur Vorbeugung von Lungenerkrankungen mit sich bringt.
Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Inhalation von 42% H 2 die histopathologischen Veränderungen der COPD verbesserte und die Lungenfunktion im CS-induzierten Maus-COPD-Modell verbesserte. COPD ist eine entzündliche Erkrankung der Atemwege, und oxidativer Stress spielt dabei eine wichtige Rolle ( 39 ). Die vorteilhaften Wirkungen von inhaliertem H 2 sind zweifellos teilweise auf seine antioxidative Eigenschaft zurückzuführen ( 9 ). Die Informationen zur H 2 -Regulierung in vivo sind jedoch begrenzt, und die beteiligten Signalmoleküle müssen weiter untersucht werden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass NF-κB eine zentrale Rolle bei der COPD-Entzündung spielt ( 37). Darüber hinaus wurde berichtet, dass ERK1 / 2 an der CS-induzierten Entzündung beteiligt ist, indem die NF-κB-DNA-Bindungsaktivität in A549-Zellen moduliert wird ( 43 ). In der vorliegenden Studie fanden wir, dass 16HBE-Zellen, die vor der Exposition gegenüber H 2 O 2 mit H 2 vorbehandelt wurden, niedrigere IL-6- und IL-8-Spiegel freisetzten und eine verringerte Aktivierung von ERK1 / 2 und NF-κB zeigten, was darauf hindeutet, dass H 2 H abschwächte 2 O 2 -induzierte Entzündung. In vivo wurden die CS-induzierte ERK1 / 2-Phosphorylierung und die NF-κB-Kerntranslokation durch H 2 -Behandlung in der Mauslunge aufgehoben . Daher ist H 2 Inhalation vermindert CS-induzierten oxidativen Stress, was zu reduzierten Entzündungsreaktionen und anschließendem Emphysem führt.
Die Lungenfunktionsanalyse ist ein wichtiges Instrument bei der Bewertung von Modellen für Atemwegserkrankungen bei Mäusen. Die am häufigsten verwendeten Lungenfunktionsvariablen des Menschen werden jedoch bei Mäusen nicht routinemäßig angewendet. Ein invasives Lungenfunktionsgerät (Zwangsmanöversystem von Buxco Research Systems) wurde verwendet, um das Mausmodell der CS-induzierten COPD zu bewerten. Eine 3-monatige CS-Exposition verursachte bei Mäusen eine Luftraumvergrößerung. In ähnlicher Weise wurden statistisch signifikante Anstiege von FRC, Cchord, FVC, DC und RI sowie eine Abnahme des FEV50 / FVC-Verhältnisses bei CS-exponierten Mäusen erhalten, was aus unseren früheren Studien bestand ( 25 , 26 ). Darüber hinaus wurde der CS-induzierte Rückgang der Lungenfunktion bei Mäusen durch H 2 abgeschwächtInhalation. Aus klinischer Sicht ist die FVC in tatsächlichen Fällen von CS-induzierter COPD normalerweise reduziert. Es war also bemerkenswert, dass die FVC bei CS-exponierten Mäusen erhöht war. Der Mechanismus hierfür ist wie folgt. Zunächst wird die menschliche Lungenfunktion während der aktiven Atmung gemessen, jedoch wurde die Maus-Lungenfunktion während der erzwungenen passiven Atmung gemessen. Zweitens wurde bei CS-exponierten Mäusen im Vergleich zur Kontrollgruppe, die beim Menschen ähnlich ist, ein statistisch signifikanter Anstieg der DC erzielt. Drittens führte das erzwungene Ausatmungsmanöver aufgrund des größeren Lungenvolumens bei maximaler Inflation bei CS-induzierten Mäusen zu einem signifikanten Anstieg der FVC, während FEV50 / FVC (Parameter für die Obstruktion des Luftstroms) während der Ausatmung signifikant verringert war.
Die Schleimhypersekretion ist einer der wichtigsten Faktoren für die Vorhersage der Morbidität und Mortalität bei COPD ( 44 ). In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass die H 2 -Inhalation die CS-induzierte Atemwegsschleimproduktion signifikant verbessert, was durch eine verringerte Hyperplasie der Atemwegskelchzellen und verringerte Spiegel von Muc5ac und Muc5b in BALF identifiziert wurde. Diese Schutzwirkung von H 2 auf die CS-induzierte Schleimhypersekretion war zumindest teilweise auf seine antioxidative Fähigkeit zurückzuführen ( 22 ).
Im Vergleich zu anderen entzündungshemmenden Arzneimitteln zur Behandlung von COPD bietet H 2 mehrere Vorteile. Erstens ist es ungiftig und reagiert mit dem Hydroxylradikal (· OH) unter Bildung von Wasser im Körper. Zweitens kann H 2 leicht in Membranen eindringen und in das Cytosol und den Zellkern diffundieren, wodurch es hochwirksam bei der Reduzierung zytotoxischer Substanzen ist ( 45 ). Drittens gibt es keinen Einfluss von H 2 auf die physiologischen Eigenschaften ( 24 , 46 ). Viertens ist die H 2 -Behandlung einfach und kostengünstig. Insgesamt ist inhaliertes H 2 eine vielversprechende, leicht zu verabreichende und unkomplizierte Therapieoption für COPD.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine hochkonzentrierte H 2 -Inhalation das CS-induzierte Lungenemphysem, die chronische Bronchitis und den Umbau kleiner Atemwege bei Mäusen sowie eine verringerte Abnahme der Lungenfunktion aufhob. Diese Schutzwirkung ist auf die entzündungshemmenden und antioxidativen Wirkungen von H 2 zurückzuführen . Die Hemmung der ERK1 / 2- und NF-κB-Signalwege kann mit den entzündungshemmenden Wirkungen von H 2 zusammenhängen . Diese Studie bietet eine Grundlage für die weitere Untersuchung der Schutzwirkung von H 2 auf COPD. Obwohl wir die vorteilhaften Wirkungen von H 2 auf die COPD in einem Mausmodell gezeigt haben, sollte seine Wirksamkeit beim Menschen in klinischen Studien bewertet werden.
Danksagung
Finanzierung : Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81670041, 81520108001, 81220108001, 81170052), des 973 Key Scheme of China (2015CB553406), des National Key R & D Project (2016YFC0903700), der Universitäten und Hochschulen der Provinz Guangdong unterstützt Von Pearl River Scholar finanziertes Programm (2014, W Lu), Schlüsselzuschuss für innovative Forschung an Universitäten und Hochschulen der Provinz Guangdong (cxzd1142), kommunales Forschungsprojekt in Guangzhou (201607020030), innovatives Team des Bildungsministeriums von Guangzhou (13C08) und Bildungsministerium von Guangzhou, Yangcheng Stipendium (12A001S).
Anmerkungen
Ethische Erklärung : Die Tiere wurden in den spezifischen Einrichtungen ohne Krankheitserreger untergebracht, und das Animal Care and Use Committee der Guangzhou Medical University genehmigte alle Versuchsprotokolle. Alle Methoden wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die vom Animal Care and Use Committee der Guangzhou Medical University genehmigt wurden.
Verweise
Artikel aus dem Journal of Thoracic Disease werden hier mit freundlicher Genehmigung von AME Publications zur Verfügung gestellt
Wasserstoffreiches, reines Wasser verhindert durch Zigarettenrauch induziertes Lungenemphysem bei SMP30-Knockout-Mäusen.
Suzuki Y1, Sato T2, Sugimoto M3, Baskoro H1, Karasutani K1, Mitsui A1, Nurwidya F4, Arano N1, Kodama Y1, Hirano SI5, Ishigami A6, Seyama K1, Takahashi K1.
1 Department of Respiratory Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Tokyo, Japan.
2Department of Respiratory Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Tokyo, Japan. Electronic address: satotada@juntendo.ac.jp.3Department of Mechanism of Aging, National Center for Geriatrics and Gerontology, Obu, Aichi, Japan.4Department of Respiratory Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Tokyo, Japan; Department of Pulmonology and Respiratory Medicine, Universitas Indonesia Faculty of Medicine, Jakarta, Indonesia.5MiZ Company Limited, Kamakura, Kanagawa, Japan.6Department of Molecular Pathology, Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology, Tokyo, Japan.Studie aus 2017 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28807355
Die schützende Wirkung von Wasserstoff (H2) auf ROS-induzierte Erkrankungen wurde von vielen Forschern nachgewiesen, die zeigten, dass H2 durch die Beseitigung von • OH und • ONOO– die Lipid- und DNA-Peroxidation wirksam abschwächen, die zellulären Antioxidationsmittel verbessern und dann die Zellen gegen Oxidationsmittelschädenschützen kann . Die meisten freien Radikale im menschlichen Körper bestehen aus ROS, einschließlich O2, OH, H2O2, NO, ONOO und so weiter. Unter normalen Umständen können Zellen eine angemessene Homöostase zwischen der Bildung und Entfernung von ROS durch bestimmte enzymatische Wege oder Antioxidationsmittel aufrechterhalten. Unter bestimmten pathologischen Bedingungen ist das Gleichgewicht jedoch gestört, was zu oxidativem Stress und verschiedenen Krankheiten wie chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) führt. Studien haben gezeigt, dass ROS eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von COPD gespielt hat und einige Antioxidantien beim Schutz vor den schädigenden Wirkungen von oxidativem Stress wirksam waren. Wir vermuten daher, dass die Wasserstofftherapie aufgrund ihrer Besonderheit, toxische ROS zu eliminieren, eine neuartige und wirksame Behandlung von COPD sein kann.
Schlüsselwörter: Wasserstoff, COPD, oxidativer Stress, Antioxidationsmittel
Einführung
Wasserstoff (H2), ein farbloses, geschmackloses, geruchloses, nicht reizendes und hochentzündliches diatomares Gas, wurde allgemein als physiologisches inertes Gas in der Überdruckmedizin angesehen. In den Jahren 1975 und 2001 haben Dole et al. (1975) und Gharib et al. (2001) separat berichtet, dass H2 unter hohem Druck ein therapeutisches Gas für Krebs und Parasiten-induzierte Leberentzündung sein könnte, indem toxische ROS eliminiert werden.
Im Jahr 2007 haben Ohsawa et al. (2007) fanden heraus, dass 2% ige H2-Inhalation antioxidative und antiapoptotische Aktivitäten zeigte, indem sie zytotoxische Sauerstoffradikale selektiv reduzierte. Die Bedeutung von H2 stieß sofort auf weit verbreitete Bedenken, und es erwies sich als wirksam bei vielen ROS-bedingten Erkrankungen, wie Verletzungen der Leber- und Herzhypoxie-Ischämie, Entzündungsverletzungen, die durch Dünndarmtransplantation verursacht wurden und bei Neugeborenen Hypoxie-Ischämie-Verletzungen (Fukuda et al. , 2007; Buchholz et al., 2008; Cai et al., 2008; Hayashida et al., 2008).
Daneben erwiesen sich andere Wege zur Verabreichung von H2, wie das Trinken von H2-gesättigtem Wasser, die intraperitoneale und intravenöse Injektion von H2-gesättigter Kochsalzlösung, auch bei vielen Erkrankungen, wie z. B. Hypoxie-Hirn-Ischämie, Typ II-Diabetes beim Menschen, durch Cisplatin induzierte Nephrotoxizität Parkinson-Krankheit und Atherosklerose bei Apolipoprotein (Cai et al., 2009; Chen et al., 2009; Mao et al., 2009; Sun et al., 2009; Zheng et al., 2009; Oharazawa et al., 2010). .
Alle diese Beweise zeigen, dass das Molekül H2 bei Erkrankungen wirksam ist, die mit oxidativem Stress in Verbindung stehen, einschließlich chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD).
Chronisch obstruktive Lungenerkrankung
Chronisch obstruktive Lungenerkrankung ist eine komplexe multifaktorielle Erkrankung, die hauptsächlich aus chronischer Bronchitis und Lungenemphysem besteht. Sie ist durch eine nicht vollständig reversible Einschränkung des Luftstroms gekennzeichnet. Das Hauptmerkmal von COPD wird allgemein als abnormale Reaktion auf Verletzungen, chronische Entzündungen, übermäßige Aktivierung von Makrophagen, Neutrophilen, T-Lymphozyten und Fibroblasten in der Lunge akzeptiert. Menschen mit leichter COPD zeigen oft physiologische Anomalien, die zu Atemnot führen und die Belastungstoleranz reduzieren, während moderate und schwere COPD die Lebensqualität und die Mortalität erheblich beeinträchtigen können.Es gibt viele Behandlungen für COPD, wie inhalatives Kortikosteroid (ICS) und Anticholinergika, Salmeterol-Fluticason-Kombination (SFC) oder Tiotropium und die Verschreibung von Antibiotika. Bisher erwies sich jedoch keines als eine ideale Behandlung für COPD. ICS könnte die Inzidenz von Pneumonien erhöhen (Drummond et al., 2008). Die Behandlung mit Anticholinergika zeigte ein höheres Risiko für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität (Singh et al., 2008). In einer anderen Studie konnte gezeigt werden, dass Tiotropium den Rückgang von FEV1 nicht reduzieren kann (Tashkin et al., 2008).
In Anbetracht der Tatsache, dass die Morbidität und Mortalität von COPD in den letzten Jahren zugenommen hat, wäre es sehr wertvoll, eine wirksame Therapie für COPD herauszufinden. Oxidativer Stress wird weithin als pathogener Mechanismus für COPD vorgeschlagen (Van der Vliet, 1999; Pinamonti et al., 1996; Repine et al., 1997).
Viele Forscher fanden Marker für oxidativen Stress wie H2O2 und NO in der epithelialen Auskleidungsflüssigkeit, dem Atem und dem Urin von COPD-Patienten (Dekhuijzen et al., 1996; Maziak et al., 1998; Praticò et al., 1998; Montuschi et al., 2000).
Es wird berichtet, dass das Oxidationsmittel Peroxynitrit, das durch die Reaktion von NO mit dem Superoxidanion erzeugt wird, stark mit COPD korreliert ist (Kanazawa et al., 2003). Das durch Superoxidanion bzw. H2O2 durch die Haber-Weiss-Reaktion und die Fenton-Reaktion erzeugte Hydroxylradikal ist ebenfalls ein stark toxisches Oxidationsmittel (Halliwell und Gutteridge, 1986, 1992). Ichinose fand reichlich Nitrotyrosin-positive Färbungszellen und iNOS-positive Zellen in induziertem Sputum von COPD-Patienten, was darauf hindeutet, dass oxidativer Stress, der durch reaktive Stickstoffspezies hervorgerufen wird, im Blut übertrieben sein kann.
Weiter Studien
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3108576/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6051853/